Zerstört Ethanol RNase?

Ich habe diesbezüglich widersprüchliche Ratschläge erhalten: Einige Leute glauben, dass man eine RNase-Kontamination einfach entfernen kann, indem man den Labortisch, Pipetten, Handschuhe usw. mit Ethanol besprüht. Andere glauben, dass Ethanol RNase nicht zerstört und dass spezielle Reagenzien erforderlich sind, um eine RNase-Kontamination zu verhindern.

Entfernt Ethanol also die RNase-Kontamination? Wenn nicht, welches Reagenz tut es?

Siehe die Antwort von Shigeta unten - "Hemmung" ist nicht wirklich der richtige Weg, um darüber nachzudenken, da dies eine bestimmte Wechselwirkung implizieren kann, wenn es um ein Enzym geht.
Guter Punkt, ich habe den Wortlaut der Frage geändert, um die Notwendigkeit einer dauerhaften Denaturierung zu vermitteln.

Antworten (2)

Ich denke, die Protokolle zum Reinigen von Glaswaren gehen kein Risiko ein und kümmern sich nur um den RNA-Abbau, anstatt auf eine Klasse von Enzymen abzuzielen.

EtOH soll RNAse und alle anderen Proteine ​​auf der Oberfläche denaturieren.

Andere Chemikalien wie Diethylpyrocarbonat (DEPC), die zum Waschen von Glaswaren verwendet werden, töten alle biochemischen Aktivitäten, indem sie mit nukleophilen Einheiten im Protein (-OH, -SH, -NH( 2/3 )) reagieren . (Siehe Kommentare unten für mehr.)

Auf diese Behandlungen folgt eine Erwärmung bei 300–450 F für 2–4 Stunden. Dies ist keine spezifische RNAse-Dekontamination – alle biologische Aktivität wird abgetötet.

Die RNAse-Aktivität wird nicht durch den spezifischen Nachweis eines bestimmten Enzyms bewertet, sondern eher durch den Abbau einer RNA-Probe in der Laborumgebung beurteilt. Eine spezifische Hemmung lohnt sich also nicht - jedes Protein, das mit RNA interagieren und diese abbauen könnte, wird in diesen Protokollen als RNAse bezeichnet.

Kurz gesagt, RNA-Kontamination und -Abbau sind in einer Laborumgebung super einfach. Wir haben in unserem Labor eine reine RNA-Workbench, die mit einer RNAse-abbauenden „Breitspektrum“-Lösung behandelt wird, bevor RNA-Arbeiten durchgeführt werden.
Die Hitzebehandlung wird als Depyrogenisierung bezeichnet und entfernt nicht nur vollständig alle biologische Aktivität, sondern zerstört auch Pyrogene (Fieberauslöser) wie LPS oder Endotoxin.
Danke, dass du das ergänzt hast, Jungs. Ich denke, Sie können sehen, wie die Reagenzien das Glas wirklich reinigen. Ich bin mit den Protokollen vertraut, habe aber selbst nicht mit RNA gearbeitet.

Sie wollen RNAsen nicht nur hemmen oder vorübergehend denaturieren, wenn Sie mit RNA arbeiten, müssen Sie die RNAsen dauerhaft inaktivieren. Ich arbeite mit RNA, und ich habe niemanden gesehen, der Ethanol verwendet hat, um RNAsen zu entfernen, ich würde nicht darauf vertrauen, dass es zuverlässig funktioniert. RNAsen sind wirklich stabile Enzyme, sie überleben teilweise sogar das Autoklavieren, daher wäre ich nicht überrascht, wenn sie sich nach Ethanolexposition wieder falten können.

Die üblichen Methoden zur Entfernung von RNAsen sind

  • Behandlung mit 0,1 % DEPC (erhitzen auf mind. 60 °C, ggf. autoklavieren, um restliches DEPC später zu entfernen). Kann nicht mit zB Tris-Puffer oder irgendetwas anderem, das damit reagiert, verwendet werden. DEPC ist krebserregend, daher sollten Sie die entsprechenden Sicherheitsverfahren befolgen.
  • Alles aus Metall oder Glas ca. 2 Stunden auf 250 °C erhitzen
  • 1 M NaOH für mindestens 30 Minuten (Sie müssen gründlich waschen, um das NaOH zu entfernen)

Sie sollten sich darüber im Klaren sein, dass alles, was RNAsen zerstört, wahrscheinlich dasselbe mit Ihrer RNA anstellt.

Das Autoklavieren schützt nicht vollständig vor RNAsen, reduziert aber dennoch die RNAse-Aktivität erheblich . Während Sie sich also nicht auf Autoklavieren verlassen sollten, um RNAsen loszuwerden, reicht es meiner Erfahrung nach aus, wenn Sie von einer Quelle ausgehen, die wahrscheinlich nicht viele RNAsen enthält. Pipettenspitzen (keine losen Spitzen aus einem Beutel, um die Handhabung zu minimieren) und Millipore-gefiltertes Wasser sind nach dem Autoklavieren ziemlich sicher.

Es gibt auch kommerzielle RNAse-Inhibitoren, aber ich habe sie nur in Fällen verwendet, in denen ich RNA und Protein mischen musste und das Protein nicht vollständig RNAse-frei war.

Zerstört Ethanol RNase?
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v