Wie wird die Abdeckung durch die Reinheit einer Probe beeinflusst? Und kann die Abdeckung einer Probe durch andere Dinge beeinflusst werden, wie die Vorbereitung der Bibliothek oder die Art und Weise, wie die Probe gelagert wurde?
Also Faktoren, die bei der Short-Read-Sequenzierung (und der Sanger-Sequenzierung) berücksichtigt werden.
Tiefe ist das Offensichtliche. Wenn alles andere gleich ist, erhalten Sie eine exakte Poisson-Verteilung der Abdeckung über ein Genom, weshalb mehr Sequenzierung = mehr Abdeckung bedeutet.
Das menschliche Genom und das Transkriptom sind nicht alle gleich. Die Illumina-Sequenzierung ist letztendlich (die meisten Protokolle) von der PCR-Amplifikation abhängig, was bedeutet, dass alle Faktoren, die die PCR-Amplifikationsfähigkeit beeinflussen, auch die Sequenzierungstiefe beeinflussen. Die zwei offensichtlichen in dieser Hinsicht sind: 1) Regionen mit extremem GC-Gehalt und 2) Regionen, die Sekundärstrukturen (hauptsächlich RNA) enthalten.
Das Alignment ist die nächste große Fehlerquelle für Regionen, die „ausgelassen“ werden, je nachdem, wie Ihr Aligner mit Multi-Mapping-Reads umgeht. Einige Genome haben sehr junge transponierbare Elemente, die einander sehr ähnlich und sehr häufig sind. Für die meisten Aligner bedeutet dies, dass Sie entweder eine große Abdeckung oder eine sehr kleine Abdeckung erhalten können, je nachdem, wie das Genom zusammengesetzt ist.
Bei Low-Input-Sequenziertechniken ergeben sich Hauptquellen für DNA/RNA-Kontamination durch die Enzyme, Reagenzien und die Vorbereitung der Proben. Dies kann weitgehend minimiert werden, indem man „saubere“ Proben hat und große Mengen an zugeführter DNA/RNA verwendet.
Abhängig von den Sequenzen, die Sie studieren, kann die Lesetiefe der einzige Faktor sein, den Sie berücksichtigen, oder wenn Sie schwierige Regionen oder spezifische Fragen haben, können Sie sich mit einer ganzen Reihe von Problemen befassen.
Als Antwort auf Ihre Frage: Ja, die DNA-Qualität wirkt sich direkt auf die Abdeckung aus. Manchmal können Sie „einfach mehr sequenzieren“, um dieses Problem zu lösen, manchmal müssen Sie zum Reißbrett zurückkehren.
Der größte Beitrag zur Sequenzierungsabdeckung (bei einem Hiseq, nehme ich an) ist die Anzahl der Reads, die Sie erhalten, was hauptsächlich davon abhängt, wie viel Prozent einer Fließzelle Sie ihr geben. Offensichtlich trägt der Rest, den Sie erwähnt haben, dazu bei, und Reinheit könnte ein großes Problem sein, wenn Sie nach einer Teilmenge von Zellen suchen, die Sie aus einem größeren Pool isolieren wollten, aber der einfachste Weg, mehr Abdeckung zu erhalten, besteht darin, mehr Immobilien in Beschlag zu nehmen die Durchflusszelle.
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