Sequenzierung zweier DNA-Stränge

Mich interessiert nur die Art der hier beschriebenen Ergebnisse.

Durch Angleichen dieser Sequenz an alle Nukleotide aller Organismen würden wir erkennen, dass die angegebene (kurze) Sequenz in verschiedenen Organismen außer Menschen vorkommt. Daher könnte es von einer Art mit nur einem Chromosom stammen siehe NCBI Blast !

Nehmen wir zum Beispiel an, dass die Spezies mehrere Instanzen jedes Chromosoms hatte (z. B. eine von der menschlichen Mutter und eine vom menschlichen Vater), und sehen Sie sich "die hier beschriebenen Ergebnisse" an. Da im Protokoll keine Einzelheiten angegeben sind, nehmen wir weiter das häufigste Szenario an – nämlich, dass es keine experimentelle Unterscheidung oder Trennung der einzelnen Instanzen von Chromosomen gab.

Wenn wir uns die Ergebnisse ansehen, würden wir feststellen, dass es sich nicht um „Next Generation Sequencing“ handelt, sondern um Sanger-Sequencing .

Nun sehen wir uns das bereitgestellte Schema noch einmal an (Anmerkung: Dies sind keine echten experimentellen Daten): Die Banden auf der linken Seite treten eindeutig nur für einen Buchstaben/eine Basis auf, und an einer bestimmten Position der Sequenz gibt es nur einen sehr deutlichen Peak auf der rechten Seite (im Gegensatz zu der Möglichkeit, mehrere Spitzen zu haben, die verschiedenen Basen entsprechen).

Wir müssten daraus schließen, dass jede Instanz des Chromosoms eine absolut identische Sequenz hat . Daraus würden wir schließen, dass es nicht wichtig wäre, einzelne Instanzen zu unterscheiden.

Aber halt – sind mütterliche und väterliche Chromosomen nicht unterschiedlich? Absolut, das angegebene Beispiel betrachtet jedoch nur 25 Basen und nicht das gesamte Chromosom - und es wäre durchaus möglich, dass sie absolut identisch sind. (Hinweis: Es gibt verschiedene experimentelle Techniken, um nur bestimmte Regionen von DNA oder RNA für die Analyse auszuwählen).

Ich würde sagen, dass Ihr Verständnis hier nicht unbedingt fehlerhaft ist – vielmehr wird Ihnen ein kleiner Streich gespielt.

Die Abbildung zeigt typische Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung. Diese Art der Sequenzierung benötigt immer einen sogenannten Primer, eine kurze Abfolge von etwa 20 bekannten Basen. Der diesen 20 Basen folgende Code wird sequenziert. Mit dieser Technik allein können Sie praktisch kein ganzes Chromosom sequenzieren - es ist normalerweise nur gut für etwa 700-1200 Basen nach dem Primer.

Die Banden in der Grafik auf der linken Seite und die Peaks auf der rechten Seite entsprechen der Basis an Position „Primer + n“ (n ist die Anzahl der Banden/Peaks, die am unteren Rand der Grafik zu zählen beginnen).

Bedenken Sie nun, dass diese Technik in der Praxis an einer flüssigen Probe durchgeführt wird, die natürlich eine große Anzahl von DNA-Molekülen enthält. Im Idealfall ist jedes einzelne Molekül identisch. In diesem Fall ist die Sequenz hinter den 20 Primerbasen identisch und Sie erhalten klare Banden oder Peaks, wie in der Grafik gezeigt.

Wenn Sie einem Organismus wie einem Menschen eine Probe entnehmen, befinden sich eine Vielzahl von DNA-Molekülen in der Mischung.

Was wird sequenziert? Ganz einfach, alles, was sich hinter dem Primer befindet, den Sie zum Sequenzieren verwenden. Wenn verschiedene Moleküle dort unterschiedliche Sequenzen haben, entstehen Banden in unterschiedlichen Spalten an gleicher Stelle auf dem Gel (linke Seite der Grafik) oder zwei verschiedenfarbige Peaks an gleicher Stelle in der Chromatographie (rechte Seite der Grafik) .

Beispiel: Genotypisierung

Wir betrachten das XYZ-Gen. Es gibt zwei Varianten dieses Gens beim Menschen, und der einzige Unterschied liegt an Position 167 des Gens, wo eine Variante ein A und die andere ein G hat. Dank des Humangenomprojekts kenne ich die vollständige Sequenz des XYZ-Gens , also gestalte ich meine Grundierung so, dass sie die Positionen 50-70 von XYZ umfasst. Daher sollte mein Sequenzierungsergebnis das XYZ-Gen ergeben, das irgendwo um Position 100 herum beginnt (selbst den Sequenzierungsreaktionen höchster Qualität fehlen ein paar Basen nach dem Primer). Wenn ich eine Probe von einem Menschen nehme, der auf beiden Schwesterchromosomen die gleiche XYZ-Variante hat, erhalte ich nur ein einziges Sequenzierungsergebnis - entweder mit A oder G an Position ~67 meiner Sequenzierung. Wenn meine Probe von einem Menschen stammt, der eine Variante auf einem Chromosom und die andere Variante auf dem anderen hat, ist meine Sequenzierung an Position ~67 mehrdeutig. und bei näherer Betrachtung habe ich zwei Varianten aus dieser Probe sequenziert: eine mit einem A und eine mit einem G an dieser mehrdeutigen Position. Auf diese Weise kann ich den Genotyp eines Menschen für dieses Gen bestimmen: homozygot XYZ^A/A , XYZ ^B/B oder heterozygot XYZ ^A/B .

PS: Lassen Sie sich hier nicht von der doppelsträngigen Natur der DNA verwirren, die Sanger-Sequenzierung sequenziert immer nur einen Strang (denjenigen, für den Sie den Primer entworfen haben)! Also zwei Schwesterchromosomen = zwei Doppelstränge = vier Einzelstränge, von denen zwei sequenziert werden, weil die anderen beiden die komplementären Sequenzen enthalten.

PPS: Die Art und Weise, wie dies funktioniert, kann große Probleme verursachen, wenn die Grundierung nicht richtig gestaltet ist. Bei 20 Basen ist es möglich, dass die gleichen 20 Basen an anderer Stelle im Genom auftauchen, und plötzlich unterscheiden sich die dem Primer folgenden Sequenzen nicht nur an einer oder zwei Positionen, sondern überall.

Das ist ein Bild der Sanger-Sequenzierung. Wenn diese Sequenzierung in einer Region durchgeführt worden wäre, in der ein diploider Organismus für einen einfachen SNP heterozygot war, würde die Trace-Datei anstelle einzelner sauberer Peaks an der Stelle des SNP zwei halbgroße Peaks mit zwei Farben für die beiden Buchstaben aufweisen an dieser Stelle vorhanden. Wenn der Unterschied zwischen den beiden Allelen mehr als nur ein einzelner Nukleotidpolymorphismus war, sieht die Trace-Datei möglicherweise ganz anders aus.

Wenn ich also sage, Chromosom 1 zu sequenzieren, was bedeutet das eigentlich?

Menschen sequenzieren nicht oft einfach ein ganzes Chromosom auf diese Weise, und so gut wie niemand würde es mehr mit der Sanger-Technologie tun. Aber wenn Sie einen diploiden Nicht-Inzucht-Organismus sequenzieren würden, würden Sie erwarten, dass an Punkten der Heterozygotie eine Mischung von Signalen erhalten wird.

Der Genotypisierung – findet ein Vergleich zwischen zwei + zwei = vier Chromosomen1 statt?

Diploide Organismen haben 2 Kopien eines bestimmten Chromosoms, nicht 4. Jedes Chromosom hat zwei Stränge, aber die Informationen über komplementäre Stränge sind identisch.

AKTUALISIEREN

Bevor Sie zur Sequenzierung kommen, müssen Sie bedenken, dass Sie nicht ein einzelnes Chromosom aus einer einzelnen Zelle sequenzieren. Sie sequenzieren eine DNA-Probe, die einer Zellpopulation entspricht, die alle Chromosomen enthält. Mir ist kein Verfahren bekannt, um auf ein einzelnes Chromosom abzuzielen, es gibt gezielte Verfahren für bestimmte Regionen auf dem Genom, die Gene umgeben .

Oder ist mein gesamtes Verständnis fehlerhaft?

Ja, ich würde sagen, mangelhaft, nicht fehlerhaft.

Das gesagt,

Wenn ich also sage, Chromosom 1 zu sequenzieren, was bedeutet das eigentlich?

Hypothetisch würde das bedeuten, dass Sie DNA von Chromosom 1 sequenzieren, die einer Population von Zellen entspricht. Das bedeutet, dass Sie die Sequenz von Chromosom 1 zur Verwendung in nachgeschalteten Analysen abrufen, indem Sie die komplementäre DNA-Sequenz polymerisieren, indem Sie sich das Verfahren der DNA-Replikation zunutze machen .

Welches der beiden Chromosomen wird sequenziert?

In Mainstream-Sequenzierungsexperimenten gibt es keine Möglichkeit, zwischen zwei Chromosomen zu unterscheiden. Die Zelle hat keine Ahnung, welches Chromosom welches ist, und Sie auch nicht, also werden beide Chromosomen gleichzeitig sequenziert. Bitte beachten Sie, dass ich gesagt habe, dass es in Mainstream-Sequenzierungsexperimenten keine Möglichkeit gibt, zwischen zwei Chromosomen zu unterscheiden

Findet ein Vergleich statt zwischen zwei+zwei=vier Chromosomen1?

Dies hat zwei Teile. Was meinst du mit vier? Wenn Sie andeuten, dass Chromosom 1 zwei Stränge hat und das 4 entspricht, dann nein, die beiden Stränge zusammen bilden ein Chromosom. Ihre Zelle hat 2n oder zwei Chromosomen 1. Wenn Sie eine Population von Zellen sequenzieren (sagen wir 1000), haben Sie zweitausend Chromosom 1, die sequenziert werden, die alle paarweise über 1000 Zellen vorhanden sind.

Finden Vergleiche statt?

In Mainstream-Experimenten vergleichen wir nicht. Allerdings gibt es Methoden zur Unterscheidung zwischen den beiden Chromosomen 1. Der älteste, den ich finden konnte, ist ein Artikel von M. Nagano über allelspezifische Sequenzierung . Da Ihre Eltern in diesem Fall gleichermaßen zu Ihrer DNA beitragen, trägt jeder von ihnen einige Mutationen, die für ihre DNA spezifisch sind. Mit dieser Funktion können wir zwischen dem väterlichen und dem mütterlichen Chromosom 1 unterscheiden.

Es gibt auch Einzelzellsequenzierung . In diesem Fall würden Sie die beiden Chromosomen 1 aus einer einzelnen Zelle sequenzieren. Theoretisch können Sie dann auch eine allelspezifische Sequenzierung an einer einzelnen Zelle durchführen, sodass Sie zwischen den beiden in der Zelle vorhandenen Chromosom 1 unterscheiden können.

Schließlich gibt es keine Möglichkeit, die beiden Stränge zu unterscheiden. Wenn Sie Ihre Daten nach der Sequenzierung wieder mit dem Referenzgenom abgleichen, werden Sie die Strängigkeit der Daten kennenlernen.

Antwort auf alte Frage

Heutzutage ist das Wort Sequenzierung gleichbedeutend mit Hochdurchsatz-Sequenzierung, und der Artikel, auf den Sie im Kommentar verlinkt haben, bezieht sich auch auf Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken (ich habe dies durch einen flüchtigen Blick verstanden).

Bei der DNA-Sequenzierung wird welcher der beiden Stränge sequenziert?

Beide werden sequenziert.

In welcher Reihenfolge werden die Ergebnisse bereitgestellt

Willkürlich

Wie werden diese beiden Stränge während der Sequenzierung sequenziert?

Wenn es sich um Single-End-Sequenzierung handelt, wissen wir nicht, welcher Strang zuerst sequenziert wurde. (Es gibt Wege, aber gehen wir der Einfachheit halber nicht dorthin)

Wenn es sich um Paired-End-Sequenzierung handelt, stammt ein Read vom Sense-Strang und der andere Read vom entgegengesetzten Strang.

Sie können sich hier ein YouTube-Video ansehen, um herauszufinden, was der Unterschied ist

Wird zuerst das Ergebnis eines Strangs geliefert, gefolgt vom anderen, oder wird nur einer der beiden Stränge sequenziert?

Beides wird gemeldet.

Die Frage, die Sie gestellt haben, ist sehr weit gefasst, ich kann eine Handvoll A4-Seiten fortsetzen und bin immer noch nicht fertig. Zu Ihrer ersten Frage kommend, sagte ich, dass beide sequenziert werden, weil wir während der Sequenzierung nicht wissen können, welcher Strang sequenziert wird (es gibt Strangsequenzierungstechniken, aber Sie sollten zuerst verdauen, was hier erwähnt / verknüpft wird, und später mit etwas mehr Forschung kommt mit einer Frage zur gestrandeten Sequenzierung zurück).

Nach der Sequenzierung erhalten Sie Ihr Ergebnis in zufälliger Reihenfolge, denn was Sie erhalten, ist nicht wirklich das Ergebnis, sondern mehr Rohdatendateien, die als FASTQ- Dateien bezeichnet werden. Informieren Sie sich ein wenig über FASTQ. Nach der Sequenzierung erhalten Sie nicht wirklich eine FASTQ, sondern eine BCL- oder Base-Call-Datei, die in FASTQ konvertiert werden muss. Diese FASTQ müssen dann nach Qualität entweder gefiltert oder nicht gefiltert und dann mit einem Referenzgenom abgeglichen werden . Hier erfahren Sie, welcher Read aus welchem ​​Strang stammt.

Sie sollten mehr über Single-End-Sequenzierung und Paired-End-Sequenzierung lesen, um besser zu verstehen, wie DNA sequenziert wird. Schauen Sie sich auch dieses Video an . Dies ist die vereinfachteste Version, die ich finden konnte. Es soll Sie neugierig machen, ohne Sie mit zu vielen Informationen zu bombardieren.

Schließlich haben Sie bei einer Single-End-Sequenzierung keine Möglichkeit, ohne Alignment zu wissen, welcher Strang sequenziert wurde, aber bei Paired End (wo ein DNA-Fragment von beiden Enden sequenziert wird und zwei Paired Reads erzeugt) richtet sich im Allgemeinen ein Partner am Sinn aus Strang, während sich der andere am Antisense-Strang ausrichtet.