Wie bestimmt man den tatsächlichen Fluss im menschlichen Stoffwechselmodell einer Zelllinie?

Ich bin kein Experte auf diesem Gebiet, aber die Quantifizierung der Genexpression ist kein einfaches Problem, obwohl es eine Möglichkeit ist.

Eine mir bekannte Lösung ist die Verwendung radioaktiver Marker. Siehe zum Beispiel diese Rezension und insbesondere den Abschnitt „Der Zell-Zell-Laktat-Shuttle“, der einige Einblicke geben könnte.

Das können radioaktive Tracer (wie [14C]Lactat), nicht-radioaktive Tracer (mit [13C] oder [2H]), „Nettoaustauschmessungen“ (ich weiß nicht genau, was das hier bedeutet, vielleicht die Art von Austauschberechnungen, die sie hier präsentieren ) und Muskelbiopsien (es ist dann möglich, die Metabolitenkonzentration beispielsweise durch enzymatische Reaktion oder Spektrophotometrie zu messen).

Zusammenfassung: Probieren Sie eine der Erweiterungen von FBA aus, die die Genregulation berücksichtigen, aber seien Sie sich der Einschränkungen bewusst. Siehe unten für Referenzen.

Lange Antwort:

Es gibt zwei Ansätze zur Schätzung interner metabolischer Flüsse: Der (hauptsächlich) experimentelle und der (hauptsächlich) rechnerische. Ich sage in erster Linie, weil selbst für den experimentellen Ansatz ein großer Rechenaufwand erforderlich ist und für den rechnerischen Ansatz experimentelle Studien herangezogen werden müssen, um realistische Modellparameter festzulegen.

Die experimentelle Bestimmung interner metabolischer Flüsse konzentrierte sich auf die 13C-metabolische Flussanalyse (13C-MFA), die wie oben erwähnt durch Kohlenstoffmarkierungsexperimente durchgeführt wurde. 13C-MFA ist kompliziert und teuer, daher gibt es einen relativen Mangel an experimentellen Daten, und die meisten Experimente decken nur wenige Flüsse im Vergleich zur Anzahl möglicher Reaktionen ab, typischerweise mehrere Tausend in Stoffwechselmodellen im Genommaßstab. Bei 13C-MFA schätzen die meisten Experimente die Flüsse in einem viel kleineren Modell (z. B. dem zentralen Kohlenstoffstoffwechsel), wobei andere mögliche Reaktionen vermieden oder ignoriert werden, und die Menge der geschätzten Flüsse variiert zwischen den Experimenten.

Modelle, die in rechnerischen Ansätzen zur Flussanalyse verwendet werden, sind typischerweise größer als die Modelle, die in 13C-MFA-Experimenten verwendet werden, und daher ist es normalerweise nicht möglich, alle Flüsse allein aus experimentellen Daten zu bestimmen. Daher wird hauptsächlich ein Ansatz namens Constraint-based Modeling (COBRA) verwendet. Die Grundannahme der meisten aktuellen Flussanalysemethoden, sowohl experimentell als auch rechnerisch, ist, dass sich die Metabolitenkonzentrationen im stationären Zustand befinden. Mathematisch lässt sich dies durch die Gleichung beschreiben

$S\overrightarrow v = 0$

Wo$S$ist eine stöchiometrische Matrix, die die Metaboliten und alle möglichen Reaktionen in Beziehung setzt (im Grunde eine kompakte Beschreibung des Stoffwechselmodells), und$\overrightarrow v$ist der Flussvektor , der alle Flusswerte enthält. Zusätzlich zu den Steady-State-Anforderungen werden typischerweise Beschränkungen auf die Aufnahme- und Ausscheidungsraten verschiedener Metaboliten angewendet, die sie auf biologisch realistische Werte begrenzen. Andere Anforderungen, wie z. B. Anforderungen für den ATP-Erhaltungsverbrauch, können ebenfalls angewendet werden.

Da es typischerweise viele mögliche Flussmuster gibt, die den obigen Beschränkungen gehorchen, wird ein Prinzip benötigt, um eine biologisch realistische Lösung aus dem Lösungsraum möglicher Flussmuster auszuwählen. Unter der Annahme, dass Zellen ihre Stoffwechselmuster in irgendeiner Weise optimieren, werden verschiedene Zielfunktionen verwendet, die versuchen, das Stoffwechselverhalten für Zellen zu erfassen. Sobald eine Zielfunktion ausgewählt ist, kann der Satz möglicher Lösungen nach dem Flussmuster durchsucht werden, das den höchsten Zielwert als Funktion des Flussvektors ergibt. Da das Ziel linear ist (einfach eine gewogene Summe von Flüssen), kann eine optimale Lösung schnell gefunden werden. Im Allgemeinen können viele verschiedene optimale Lösungen für eine gegebene Zielfunktion existieren.Die Methode zum Anwenden einer Zielfunktion auf ein eingeschränktes Stoffwechselmodell im Steady State wird als Flux Balance Analysis (FBA) bezeichnet.

Das grundlegendste und beliebteste Ziel ist die Maximierung der Biomasseproduktion. Dieses Ziel ist zwar für die Bestimmung maximaler Wachstumsraten nützlich, aber bei der Anwendung auf menschliche Zellen wahrscheinlich nicht realistisch. FBA und verwandte Methoden sind im Allgemeinen gut geeignet, um Leistungsgrenzen für einzelne Endpunkte wie Wachstumsrate oder Produktion eines einzelnen Metaboliten zu bestimmen, sind jedoch nicht in der Lage, alle internen Stoffwechselflüsse genau zu bestimmen. Der Punkt, dass viele optimale Lösungen für eine einzelne Zielfunktion existieren können, ist in dieser Hinsicht wichtig.

Da 13C-MFA und FBA auf demselben Konzept des Metabolitenausgleichs basieren, können sie als unterschiedliche Enden desselben Spektrums angesehen werden, von rein experimentell bis rein rechnerisch, mit 13C-MFA-beschränkter FBA (wobei 13C-MFA-Ergebnisse verwendet werden). Beschränken Sie die möglichen Flüsse in einem Modell, bevor Sie eine Zielfunktion optimieren, oder minimieren Sie den Unterschied zwischen den experimentellen Flüssen und der FBA-Lösung, vorbehaltlich zusätzlicher Einschränkungen) in der Mitte.

Für eine Einführung in die Flussbilanzanalyse siehe Orth, Thiele & Palsson: "What is flux balance analysis?" Nature Biotechnology 28 245-48 2010.

Zur Durchführung der Flussbilanzanalyse sind mehrere Softwarepakete verfügbar. Eines der am häufigsten verwendeten ist die COBRA Toolbox für Matlab. Eine Version für Python namens CobraPy ist ebenfalls in Entwicklung. Beide sind unter http://opencobra.sourceforge.net/openCOBRA/Welcome.html verfügbar

Beachten Sie, dass die meisten Genexpressionsdaten nur relative Veränderungen der Expression zwischen zwei Bedingungen zeigen. Die meisten Methoden basieren daher auf dem Vergleich zweier unterschiedlicher Bedingungen. In jüngerer Zeit kann auch die RNA-Sequenzierung (RNAseq) verwendet werden, um direktere Messungen der Genexpressionsniveaus zu erhalten. Viele Erweiterungen und Variationen von FBA wurden veröffentlicht, die die Genexpression berücksichtigen. Einige davon sind regulatorische FBA (rFBA, Covert & Palsson: Journal of Biological Chemistry, 2002 277, 28058-28064 ), Metabolic Adjustment by Differential Expression (MADE, Jensen & Papin: Bioinformatics. 2011 Feb 15;27(4):541 -7 ) und iMAT (Schlomi et al: Bioinformatics (2010) 26 (24): 3140-3142.). Für eine neuere Methode, gx-FBA (Gene-Expression-FBA), siehe *Navid & Almaas, BMC Systems Biology 2012, 6:150).

Vielleicht möchten Sie auch diesen Artikel lesen, der sich mit der Konstruktion gewebespezifischer Stoffwechselmodelle befasst: Computergestützte Rekonstruktion gewebespezifischer Stoffwechselmodelle: Anwendung auf den menschlichen Leberstoffwechsel. Mol Syst Biol. 7. September 2010; 6:401. doi: 10.1038/msb.2010.56.

Das Problem bei der Verwendung von FBA und verwandten Methoden zur Abschätzung interner Flüsse besteht darin, dass die Validierung der Ergebnisse aufgrund des erwähnten Mangels an experimentellen Daten schwierig ist. Ich habe im letzten Jahr meines Masters einen Projektbericht zu dem Thema geschrieben, der eine grundlegende Beschreibung von 13C-MFA enthält. Es kann unter http://www.slideshare.net/jarlemag/rapport-31295058 gelesen werden

Sie können die Genexpression nicht verwenden, um Flüsse abzuschätzen. Die Gründe sind wie folgt. Die Genexpression bestimmt die mRNA-Spiegel, die wiederum die Enzymspiegel bestimmen. Die Beziehung zwischen Genexpression und Enzymspiegel ist jedoch nicht linear. Ihr größtes Problem ist jedoch, dass die Flussmittel systemabhängige Eigenschaften sind und nicht von einem einzelnen Enzym abhängen. Ein Fluss ist im Prinzip eine Funktion aller kinetischen Eigenschaften jedes Enzyms im Stoffwechselweg. Der einzige Weg, die Flüsse zu erhalten, ist entweder die direkte Messung oder die Verwendung von FBA oder kinetischen Modellen.