Analyse von Durchflusszytometriedaten [geschlossen]

Haftungsausschluss: Setzt voraus, dass Sie wissen, wie Durchflusszytometrie funktioniert.

Sie haben hier einen Flow-basierten AnnexinV-Apoptose-Assay durchgeführt.

Das Protein Annexin A5 (AnnexinV) bindet an Phosphatidylserin (PS), das typischerweise im inneren Blatt lebender Zellen reichlich vorhanden ist. Es ist bekannt, dass PS bei der Initiierung der Apoptose zum äußeren Blatt umschlägt. Daher können Sie AnnexinV verwenden, das an ein fluoreszierendes Molekül wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugiert ist, um externalisiertes PS zu untersuchen.

7-Aminoactinomycin D oder 7-AAD ist ein fluoreszierender Interkalator, der zum Nachweis von DNA verwendet werden kann und auf dem 488-nm-Laser angeregt wird (emittiert auf einem 650-nm-Langpassfilter oder dergleichen). Der Farbstoff ist für lebende Zellen nicht durchlässig und bindet daher für tote oder sterbende Zellen mit beeinträchtigter Membrandurchlässigkeit frei an DNA.

Das Problem mit beiden allein ist, dass Sie nicht sagen können, dass eine 7-AAD+-Zelle apoptotisch ist, und Sie können nicht sagen, dass eine AnnexinV+-Zelle apoptotisch ist, weil wir wissen, dass Sie frühe Apoptose und späte Apoptose haben, und in beiden Fällen ist die Zelle noch nicht vollständig tot . Sie haben auch Nekrose.

Und so können Sie auf einem Punktdiagramm von 7-AAD und Annexin V 4 Quadranten basierend auf dem Mechanismus der beiden Komponenten erstellen:

Double-negative: No external PS or DNA binding means these are viable cells.
Double-positive: Both external PS and membrane instability means late apoptosis.
AnnexinV single-positive: Undergoing early apoptosis, nucleus isn't yet permeable.
7-AAD single-positive: Completely dead or necrotic, membranes have probably disintegrated.

Die Grundlage des Assays ist, dass Sie versuchen zu bestimmen, in welchem ​​​​Stadium des Zelltods sich Ihre Zellen befinden.

Die ungefärbte Kontrolle ist eine Möglichkeit, nur Ihre Zellen zu betrachten, und ermöglicht Ihnen die Korrektur der Autofloreszenz , der von Ihren Zellen allein durch Erregung erzeugten Fluoreszenz. Sie möchten auch Einzelfleckkontrollen durchführen, um zu sehen, wo Ihre positiven und negativen Populationen liegen. Ohne FMO-Kontrollen (Fluoreszenz minus eins, im Grunde Ihr vollständiges Färbefeld minus eine Farbe) ist es aufgrund der Auswirkungen von Spillover und Rauschen schwierig, während des Gatings sicher zu sagen, wo Ihre positiven und negativen Werte abgegrenzt sind.

Ein Hinweis zur AnnexinV-Einzelfleckkontrolle: Sie sehen, dass in der unbehandelten Probe praktisch kein AnnexinV vorhanden ist, in der Kontrolle aber 22,0 % der Zellen. Einzelfleckkontrollen, bei denen Sie davon ausgehen, dass positive Ergebnisse vorhanden sind, müssen positive und negative Ergebnisse aufweisen. Ohne Positive, wo setzen Sie das Tor für sie? Was passiert, wenn sich die Population während des Erwerbs verschiebt? Sie verwendeten wahrscheinlich Zellen, die absichtlich starben, um verlässliche Kontrollen für diese Probe zu erzeugen.

Das ist die linke Hälfte Ihrer Daten . Die rechte Hälfte sind Behandlungen . Grundsätzlich haben Sie die Zellen für beide Marker gefärbt und sie dann mit Torin2, Rapamycin und Mitomycin behandelt, um zu sehen, wie diese Verbindungen die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen. Es gibt ein Steuerelement, bei dem Sie nichts hinzugefügt haben.

Anhand der mit den Kontrollen gesetzten Gates können Sie sehen, dass die Mitomycin-Probe die größte Wirkung hat: Die Zellen sind zu 6,54 % AnnexinV-positiv, durchlaufen eine frühe Apoptose, und 14,3 % sind doppelt positiv, durchlaufen eine späte Apoptose, und 8,09 % sind tot oder nekrotisch.

Die Schlussfolgerung, die Sie daraus ziehen würden, ist, dass Mitomycin, aber nicht die anderen Verbindungen, eine tiefgreifende Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen hat.