Ich sortiere eine 293 abgeleitete Zeile. Eine Sache, die mir Sorgen bereitet, ist die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Sortierung. Normalerweise habe ich bei Raumtemperatur (auf der Arbeitsplatte) auf einem Nutator gefärbt und gewaschen. Ich habe gelesen, dass die meisten Sortierverfahren angeben, dass Sie dies bei vier Grad im Dunkeln tun sollten. Ich verstehe, dass dies beim Verklumpen hilft, aber geht dies auf Kosten der Lebensfähigkeit? Verursacht die Kälte diese Zellen zur Apoptose?
Derzeit ist mein Verfahren wie folgt -
Unter Verwendung von HBSS + 1 mM EDTA + 1 % BSA (Sortierpuffer) suspendiere ich ungefähr 10–15 Millionen Zellen pro ml.
Mit Primärfarbe färben
Zentrifugieren Sie bei 300 xg für 5 Minuten
Fügen Sie 15 ml Sortierpuffer hinzu und drehen Sie erneut
Färben Sie mit Sekundär in 1 ml Sortierpuffer
Waschen Sie x2 mit 15 ml
Beanspruchung
Sortieren
Eine Sache, die ich tun kann, um den Zelltod zu minimieren, ist eine Lebend/Tot-Färbung (wir haben diese Fähigkeit gerade hinzugefügt). Das andere, was ich gelesen habe, war die Verwendung von 50 % FBS in Ihrem Sammelröhrchen.
Die andere Sache, die von Belang sein könnte, ist, dass, wenn wir viele Sortierungen durchführen, einige der Röhrchen möglicherweise lange Zeit in der Warteschlange im Sortierpuffer sitzen. Wie lang ist zu lang?
Schließlich verwenden wir Puromycin und Blasticidin als Selektionsmarker für unsere Bibliotheken, und wir fügen diese normalerweise gleich nach der Neuplattierung der Sortierung hinzu. Sollen wir eine Weile warten?
Danke für den Hinweis
Sie haben mehrere Fragen, bitte versuchen Sie Ihre Beiträge auf jeweils eine Frage zu beschränken. Davon abgesehen werde ich versuchen, auf jedes Ihrer Anliegen einzugehen.
Verursacht die Kälte diese Zellen zur Apoptose?
Nein. Das Färben bei 4 °C und das Waschen mit kaltem Puffer dienen zwei Zwecken – der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit (alle zellulären Prozesse verlangsamen sich bei niedrigeren Temperaturen) und der Verhinderung der Internalisierung des Rezeptors. Dieser zweite Punkt ist besonders kritisch, da Sie einen primären und einen konjugierten sekundären Antikörper verwenden, den ich wirklich nicht zum Sortieren empfehlen würde, es sei denn, dies ist unbedingt erforderlich, z. B. wenn der von Ihnen verwendete Antikörper nicht in einem direkt konjugierten Format verfügbar ist.
Eine Sache, die ich tun kann, um den Zelltod zu minimieren, ist eine Lebend/Tot-Färbung (wir haben diese Fähigkeit gerade hinzugefügt).
Lebend/Tot-Färbemittel sind im Allgemeinen eine gute Idee, aber stellen Sie sicher, dass das Färbemittel, das Sie verwenden, nicht zytotoxisch ist. L/D sollte immer der letzte Färbeschritt sein, bevor Sie Ihre Proben analysieren. Ein besserer Weg (sofern Ihr Sortierer dies unterstützt) besteht darin, Höhen- und Flächenmessungen mit Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) zu verwenden, um einzelne Zellen geeigneter Größe zu unterscheiden, und dann zuerst auf sie zu sperren, bevor Sie auf Ihre Antikörperfärbung (FITC oder PE oder was auch immer Ihre Sekundarstufe ist).
Das andere, was ich gelesen habe, war die Verwendung von 50 % FBS in Ihrem Sammelröhrchen.
Ich bin mir nicht sicher, wie viel das helfen wird, besonders 293er, die ziemlich hart sind. Stellen Sie nur sicher, dass Sie die gesammelten Zellen ausreichend mit Medium verdünnen, um den Serumprozentsatz wieder auf 10 % zu senken.
Wenn wir viele Sortiervorgänge durchführen, können einige der Röhrchen lange Zeit in der Warteschlange im Sortierpuffer sitzen. Wie lang ist zu lang?
Solange Ihre Proben im Dunkeln auf Eis oder bei 4 ° C aufbewahrt werden, sollten sie mindestens einige Stunden in Ordnung sein (ich würde jedoch nicht über Nacht gehen). Stellen Sie außerdem sicher, dass Ihr Sammelmedium gekühlt ist, da es die Zellen schockieren kann, damit sie zu schnell von 4 ° auf 37 ° gehen. Sammeln Sie Ihre Probe, plattieren Sie sie, legen Sie sie dann bei Raumtemperatur oder in den Inkubator (abhängig von Ihrem Arbeitsablauf) und lassen Sie sie auf diese Weise aufwärmen.
Schließlich verwenden wir Puromycin und Blasticidin als Selektionsmarker für unsere Bibliotheken, und wir fügen diese normalerweise gleich nach der Neuplattierung der Sortierung hinzu. Sollen wir eine Weile warten?
Nö, mach dir keine Sorgen. Sie können warten, wenn Sie möchten, oder es sofort hinzufügen - ich würde eher dazu tendieren, es so schnell wie möglich hinzuzufügen, damit Sie unerwünschten Zellen keine Chance geben, herauszuwachsen.
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