Magnetisch aktivierte Zellsortierung vs. FACS

Magnetic-activated cell sorting (PDF-Download), kurz MACS, ist ein von Miltenyi Biotec entwickeltes Verfahrenzur Trennung von Zellen aus komplexen Mischungen unter Verwendung von mit Antikörpern beschichteten magnetischen Nanopartikeln. Die Antikörper sind spezifisch für bestimmte Zelloberflächenmarker, die entweder auf Ihrer interessierenden Population exprimiert werden (positive Selektion) oder auf unerwünschten Zelltypen exprimiert werden (negative Selektion). Nach Zugabe der Antikörper-beschichteten Kügelchen zum Zellgemisch und Inkubation wird die Suspension auf eine spezielle Einweg-Trennsäule gegeben, die an einem Magneten befestigt ist, an dem die Kügelchen haften bleiben, während unmarkierte Zellen durchfließen. Wenn Sie eine negative Selektion durchführen, ist der Durchfluss Ihre interessierende Population und die gebundenen Kügelchen und Zellen werden verworfen. Wenn Ihre interessierenden Zellen an die Kügelchen gebunden sind (positive Selektion), wird die Säule mehrmals gewaschen, um sicherzustellen, dass ungebundene oder schwach gebundene Zellen durchgespült werden.

Bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung oder FACS wird die anfängliche komplexe Zellmischung zuerst mit einem oder mehreren Zelloberflächenmarker-spezifischen Antikörpern markiert, die an fluoreszierende Farbstoffe konjugiert wurden. Es können auch Zellen analysiert werden, die ein oder mehrere rekombinante fluoreszierende Proteine ​​in Verbindung mit einem interessierenden Gen exprimieren, was eine Selektion von Zellen ohne Verwendung von Antikörpern ermöglicht. Nach Inkubation und Waschschritten werden rote Blutkörperchen lysiert, wenn Vollblut analysiert wird. Der Grund für die RBC-Lyse ist unten dargestellt:

Ohne Lyse überwältigen die RBCs das Zytometer, da sie etwa 95 % der Zellen im menschlichen Vollblut ausmachen. Weiße Blutkörperchen (Leukozyten) machen dagegen nur 0,1–0,2 % der Zellen aus und Lymphozyten etwa 15 bis 50 % der Leukozyten.

Das Zellgemisch wird dann auf einem Zellsortierer wie einem BD FACSAria analysiert .

^{Von: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fluorescence_Assisted_Cell_Sorting_%28FACS%29_B.jpg}

Die Zellen passieren im Gänsemarsch einen oder mehrere Laserstrahlen, die die Farbstoffe anregen und bei einer bestimmten Wellenlänge zum Leuchten bringen. Der Benutzer kann dann per Gating die Kombination und Intensität der Farben auswählen, die ihn interessieren, und wenn eine Zelle die Kriterien erfüllt, wird sie elektrisch aufgeladen und Elektromagnete leiten sie in einen Sammelbehälter.

Was sind also die Vor- und Nachteile der einzelnen Technologien? Die MACS-Trennung ist im Allgemeinen schneller als die FACS-Färbung, und es kann eine größere Anzahl von Zellen gleichzeitig verarbeitet werden (manchmal um Größenordnungen mehr, je nach Instrument und Protokoll). Wenn Sie beispielsweise eine große Anzahl von CD4+-T-Zellen aus Vollblut aufreinigen möchten, ist MACS möglicherweise die bessere Wahl der beiden (obwohl ich die RosetteSep bevorzugeSystem für diese spezielle Anforderung). MACS erfordert kein ziemlich teures dediziertes Instrument, obwohl bei Bedarf automatische Plattformen verfügbar sind. Auf der anderen Seite sind die meisten MACS-qualifizierten Beads meist nur von Miltenyi erhältlich. Wenn sie also keine Beads mit Ihrem speziellen interessierenden Marker zur Verfügung haben, müssen Sie die Konjugation selbst durchführen, was Zeit und möglicherweise wertvolle Antikörper kostet Sie optimieren die Bedingungen. Fluoreszenz-konjugierte Antikörper sind weit verbreitet und von praktisch unzähligen Unternehmen erhältlich. Wenn Sie also nicht mit einem selbst hergestellten Antikörper arbeiten, ist es viel wahrscheinlicher, dass Sie ganz einfach einen für FACS finden werden. Es gibtMACS-Beads, die Antikörper enthalten, die gegen bestimmte Fluorophore gerichtet sind, sodass Sie Flow-Antikörper für MACS verwenden können, obwohl wahrscheinlich noch eine Optimierung erforderlich ist. Schließlich ist die MACS-Trennung nur eine Option für Zellen, die Ihren interessierenden Marker auf der Zelloberfläche exprimiert haben.

Einer der Hauptvorteile von FACS ist die Mehrfarbenfärbung (abhängig vom verwendeten Instrument). Dies macht es viel einfacher, potenziell seltene Populationen zu reinigen, die sich nur durch ihre kombinierte Expression einer Reihe von Oberflächenmarkern unterscheiden, was mehrere Gating-Schritte erfordert. Wenn dies durch MACS erreicht werden sollte, müssten Sie mehrere Reinigungsrunden durchlaufen, was länger dauern könnte als FACS und nicht unbedingt durchführbar ist, da für jeden MACS-Lauf eine bestimmte Anzahl von Zellen erforderlich ist. Mit FACS können diese seltenen Populationen (die möglicherweise nur Dutzende oder Hunderte von Zellen pro Million umfassen) genauso einfach gesammelt werden wie häufigere. Außerdem sind, wie oben erwähnt, mehr Antikörper für Flow/FACS verfügbar als für direktes MACS. Zusätzlich,