Was ist der Vorteil des indirekten ELISA gegenüber dem direkten?

Sie haben Recht, der Selektivitätsvorteil eines indirekten oder Sandwich-ELISA ergibt sich aus der Tatsache, dass zwei Antikörper verwendet werden – einer, um den Analyten einzufangen, der andere, um ihn nachzuweisen .

Hier ist die klassische Illustration, wie diese Art von ELISA funktioniert. Zuerst ( [1]) wird der Capture-Antikörper auf die Platte aufgetragen und über eine von mehreren verschiedenen Arten von Chemie gebunden. Die Platte wird dann gewaschen (dies geschieht zwischen allen Schritten). [2], der Analyt wird zugegeben, manchmal in einer homogenen Lösung (dh reines rekombinantes Protein), manchmal in einer Matrix wie Serum, Zelllysat usw. Der plattengebundene Antikörper hat eine gewisse Spezifität für den Analyten – sagen wir, er bindet den falsches Epitop einmal in 1000. [3]Der Erkennungsantikörper wird hinzugefügt, und nehmen wir an, er hat die gleiche Spezifität von 1/1000. Schließlich wird [4]der sekundäre Antikörper (mit dem daran gebundenen Enzym) hinzugefügt, und [5]das Substrat des Enzyms wird hinzugefügt, wodurch die Farb- oder Lichtausgabe erzeugt wird.

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Wenn wir einen direkten ELISA verwenden würden, wäre die Fehlerrate 1/1000. Durch die Kombination von zwei Antikörpern ist unsere Fehlerquote jedoch jetzt 1000-mal niedriger – 1 zu 1 Million. Da beide Antikörper richtig binden müssen, um ein Signal zu erhalten, macht dies die Ergebnisse viel zuverlässiger.

Es ist oft nicht unbedingt eine Frage nach Vor- und Nachteilen, sondern eine Frage, die von den verfügbaren Reagenzien und der Frage bestimmt wird, die gestellt wird. Wenn Sie beispielsweise einen Test für die Antikörperantwort auf ein Antigen nach einer Immunisierung entwickeln, verwenden Sie wahrscheinlich ein Protokoll wie dieses:

1. Platten mit Antigen von Interesse beschichten (in Zukunft Blockieren/Waschen nach Bedarf annehmen)
2. verdünntes Serum von Versuchstieren/Probanden zugeben

3. Fügen Sie einen markierten sekundären Antikörper hinzu, der für dieses Tier/Subjekt spezifisch ist

   • ein markierter sekundärer Antikörper muss verwendet werden, da der eigene Antikörper des Tieres (natürlich) nicht markiert ist.

Wenn Sie Ihren eigenen markierten Antikörper im Labor herstellen und dies zuvor getan haben, können Sie sowohl einen direkten als auch einen indirekten ELISA durchführen, um zu überprüfen, ob Sie den Antikörper markiert haben, und um die Qualität der Markierung zu bestimmen. Angenommen, Sie haben einen biotinylierten Maus-Antikörper hergestellt.

führen Sie einen direkten ELISA durch (um die Markierung zu quantifizieren): 1. beschichten Sie mit Zielantigen 2. fügen Sie Verdünnungsreihen Ihres Antikörper-Biotins hinzu 3. fügen Sie Streptavadin-alkalische Phosphatase zum Nachweis hinzu

ein zweiter indirekter ELISA (um Antikörper zu quantifizieren): 1. Beschichten mit Zielantigen 2. Fügen Sie Verdünnungsreihen Ihres Antikörper-Biotins hinzu 3. Fügen Sie biotinylierten Anti-Maus-Antikörper hinzu 4. Fügen Sie Streptavadin-alkalische Phosphatase zum Nachweis hinzu

Jetzt wissen Sie, wie viel Antikörper (aus dem indirekten ELISA) Ihnen wie viel Signal (aus dem direkten ELISA) gegen bekannte Mengen Ihres Beschichtungsantigens geben wird.

Einmal haben Sie möglicherweise tatsächlich die Möglichkeit, einen direkten oder indirekten Assay durchzuführen, wenn Sie alle benötigten Reagenzien haben, aber Ihr Signal ausreichend verstärken müssen, um geringe Mengen nachzuweisen. In diesem Fall hat ein direkter ELISA nur die Markierung eines Antikörpers, während ein sekundärer Antikörper (z. B. Anti-Schwerkette) zu einer Markierung vieler Antikörper pro Ziel führen kann.

Thermo hat dazu eine nette Seite.

Ich stimme den anderen Antworten zu und der größte Unterschied ist in der Tat die Spezifität. Ein indirekter ELISA ist tatsächlich spezifischer, aber auch aus einem Grund, der hier noch nicht beschrieben ist: Bei der Verwendung eines indirekten ELISA wird Ihre Platte mit dem primären Antikörper beschichtet. Da dieser primäre AB mit seiner schweren Kette an der Well-Oberfläche befestigt ist, stehen die 2 leichten Ketten (= die Teile, die Antigene binden, in diesem Fall die sekundären ABs) zur Verfügung, um den sekundären AB zu binden. Das bedeutet, dass jeder 1 der primären ABs das Potenzial hat, 2 sekundäre ABs zu binden, wodurch das spezifische Signal erheblich erhöht wird.