Führt die Denaturierung von Proteinen zum Verlust von Epitopen?

Ich mache ein Experiment, bei dem ich sowohl Immunhistochemie als auch SDS-PAGE machen muss. Ich gehe davon aus, dass die native Konformation des Proteins im IHC erhalten bleibt. Aber während des Blots erhitzen wir das Protein (zumindest in unserem Labor) auf 95 ° C in Mercaptoethanol, um das Protein zu denaturieren, indem wir die Disulfidbindungen aufbrechen und dadurch die Tertiärstruktur zerstören.

Meine Frage ist, wenn wir denselben Antikörper gegen das Protein im Gewebe (intakt für IHC) und isoliertes (denaturiertes für SDS-PAGE) Protein verwenden, wie kann es beide binden ? Also binden die Antikörper an das Epitop basierend auf der AA-Sequenz oder der 3D-Konformation? Würde es nicht viel Kreuzreaktivität geben, wenn es nur basierend auf der Sequenz bindet (da Sie in vielen Proteinen dieselbe Sequenz haben könnten, ist es viel unwahrscheinlicher, dieselbe Konformation zu haben)?

Antworten (2)

Viele, aber nicht alle B-Zell-Epitope werden durch Denaturierung zerstört. Diejenigen, die konformativ sind, werden zerstört, aber es gibt auch viele B-Zell-Epitope, die linear sind, basierend nur auf der Aminosäuresequenz ohne starke Konformationsabhängigkeit.

Abhängig von Ihrem IHC-Protokoll gibt es auch oft einen Fixierungsschritt, der ein gewisses Maß an Denaturierung beinhaltet, wenn auch selten so drastisch wie beim Immunoblotting. Umgekehrt sind einige Proteine ​​in der Lage, die native Konformation zumindest teilweise wiederherzustellen, nachdem sie an Ihr Blotting-Substrat gebunden haben.

Unterm Strich ist es unvorhersehbar, aber es funktioniert oft genug, um es einen Versuch wert zu machen.

Danke! Bedeutet dies also, dass, wenn der Ab-Hersteller sagt, dass es sowohl für den Blot als auch für IHC funktionieren würde, es sich um ein lineares Epitop handelt, an das es bindet?
Wahrscheinlich, obwohl es auch Epitope gibt, die nicht linear sind, die eine Denaturierung überstehen können (ich habe davon gehört; ich weiß nicht, was mit diesen passiert), und wie gesagt, IHC führt oft zu einer gewissen Denaturierung und Blotting-Substrate können teilweise wiederhergestellt werden Konformation. Eine andere Möglichkeit ist natürlich, dass sich der Hersteller irrt.

Kurze Antwort – Wenn derselbe Antikörper sowohl für IHC als auch für SDS-PAGE funktioniert, bedeutet dies entweder, dass er monoklonal gegen ein lineares Oberflächenepitop oder ein polyklonaler Antikörper ist.

Lange Antwort -

Ausgehend von der Art der Epitope gibt es im Großen und Ganzen zwei Arten von Antikörpern. Das Epitop kann entweder linear oder konformativ sein . Hier ein paar Bilder, die das verdeutlichen sollen.

Ein Konformationsepitop ist möglicherweise nicht gültig, wenn das Protein seine Struktur verliertEin lineares Epitop ist gültig, wenn es denaturiert ist und selbst wenn die Sequenz auf der Oberfläche liegt

Kommen wir nun zu den Techniken, bei IHC kann man erwarten, dass die Konformation intakt ist, obwohl es wenig Denaturierung gibt. Andererseits erfordert SDS-PAGE , dass das Protein in lineare Strukturen gezogen wird, damit sie das Gel passieren können.

Wenn der Hersteller sagt, dass der Antikörper monoklonal ist und sowohl für IHC als auch für den Blot verwendet werden kann (Hersteller erwähnen die Kompatibilität des Antikörpers mit verschiedenen Techniken und Arten), ist er höchstwahrscheinlich von einem linearen Peptid auf der Oberfläche des Proteins abgeleitet . Dies bedeutet, dass es für IHC (da es ein Oberflächenepitop benötigt) oder SDS-PAGE (das ein lineares Epitop benötigt) funktionieren würde. Denken Sie daran, dass ein Oberflächenepitop entweder konformativ oder linear sein kann. Monoklonale Abs werden durch die Hybridoma-Technik hergestellt.

Wenn der Antikörper andererseits polyklonal ist, ist es viel wahrscheinlicher , dass dieser Satz einige IgGs enthält, die lineare Epitope binden, und einige, die Oberflächenepitope binden. Daher ist es viel wahrscheinlicher, dass ein polyklonaler Antikörper sowohl auf SDS-PAGE als auch auf IHC funktioniert. Es ist auch etwas einfacher herzustellen, da es im Wesentlichen nur gereinigte Antiseren von einem Tier sind, das mit dem interessierenden Antigen immunisiert wurde.

Führt die Denaturierung von Proteinen zum Verlust von Epitopen?
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