Wie bereite ich eine Probe für die SDS-Seite vor?

Die Probenvorbereitung für Proteingele ist keine komplexe Aufgabe. Mischen Sie einfach die entsprechende Menge Probenpuffer mit Ihrer Probe und laden Sie sie. Verwenden Sie für einen 2x-Probenpuffer gleiche Mengen Probe und Puffer, für einen 5x-Probenpuffer 4 Teile Probe und 1 Teil Puffer (z. B. 40 µl + 10 µl). Erhitzen Sie die gemischten Proben für 5 Minuten auf 95°C, kühlen Sie sie sofort auf Eis ab und geben Sie eine angemessene Menge davon auf das Gel. Wie viel möglich ist, hängt wirklich von der Art des Gels ab, das Sie verwenden - 20-30 µl sollten normalerweise möglich sein.

Laden Sie nicht zu viel Protein, sonst können Sie es nicht richtig trennen. Normalerweise verwende ich zwischen 20-30 µg Gesamtprotein pro Vertiefung oder nur 50 ng für gereinigte Proteine ​​​​(dies hängt auch von den Antikörpern ab).

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Für Probenpuffer verwende ich normalerweise die folgenden Rezepte. Ich bevorzuge das 5x, da ich mehr Protein laden kann, wenn die Zubereitung nicht sehr gut ist. Ich bevorzuge auch die Verwendung von DTT gegenüber Mercaptoethanol, da es viel weniger stinkt. Wenn Sie kein DTT haben (oder Mercaptoethanol bevorzugen), kann es durch eine gleiche Menge ersetzt werden (200 mM im 2x-, 500 mM im 5x-Puffer). Wenn Sie DTT verwenden, müssen Sie Aliquots des Puffers herstellen und bei -20 °C lagern, ein Arbeitsaliquot kann etwa zwei Wochen lang bei 4 °C aufbewahrt werden.

2x Probenpuffer:

• 4 % SDB
• 20 % Glycerin
• 100 mM Tris-Cl, pH 6,8
• 2 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)
• 200 mM DTT (Dithiothreit)
• 0,1 % (w/v) Bromphenolblau-Farbstoff

5x Probenpuffer

• 10 % SDB
• 50 % Glycerin
• 250 mM Tris-Cl, pH 6,8
• 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)
• 200 mM DTT (Dithiothreit)
• 0,25 % (w/v) Bromphenolblau-Farbstoff