Ich hoffe, die Wachstumsraten einer Bakterienkultur unter verschiedenen Wachstumsbedingungen messen zu können. Ich befürchte, dass diese Wachstumsbedingungen Zelltod verursachen könnten, was zu einer verringerten Übereinstimmung zwischen optischer Dichte und Anzahl lebender Zellen führen würde, daher möchte ich die Anzahl lebender Zellen unabhängig messen. Ich verstehe, dass das Ausplattieren serieller Verdünnungen einer Kultur und das Zählen der Anzahl der Kolonien zur Berechnung der koloniebildenden Einheiten (CFU) pro ml der Goldstandard für die Messung der Anzahl lebensfähiger Zellen ist. Ich habe jedoch sieben verschiedene Bedingungen, die ich parallel testen möchte, und die Herstellung von mehr als 3 Platten für jede Bedingung (um Reihenverdünnungen durchzuführen) und die Durchführung von Messungen an mehreren Punkten in der Wachstumskurve führt zu einer Mengevon Platten. Im Allgemeinen scheint diese Methode arbeitsintensiver zu sein als das, was ich brauche. Ich mache das hauptsächlich als Plausibilitätsprüfung, also scheint es eine Menge Arbeit nur für eine Plausibilitätsprüfung zu sein.
Meine Frage ist: Gibt es alternative Methoden zur CFU-Plattierung zur Messung der Zellviabilität, da ich viele Experimente parallel durchführe? Ich habe keinen Zugang zu einem FACS-Gerät, also funktioniert die Zellsortierung nicht. Ich habe diese Frage zur Messung lebender Zellen in Algen gelesen. Ich bin mir nicht sicher, ob ein Hämozytometer die richtige Alternative für meine spezielle Hochdurchsatzanwendung ist (obwohl Sie mich vom Gegenteil überzeugen könnten). Die beste Antwort auf diese Frage wäre ein Vergleich der Präzision, Genauigkeit, Empfindlichkeit und Benutzerfreundlichkeit dieser alternativen Methode mit CFU-Plattierung aus Erfahrung.
Vielen Dank!
Ich habe es nur für Säugetiere verwendet, aber der Cedex HiRes Analyzer von Roche ist ziemlich süß. Aus ihren Dokumenten können Sie Partikel mit einer Größe von 1 bis 90 μm analysieren (die Zellen, mit denen ich arbeite, sind etwa 20 μm groß), und je nach Ihren Anforderungen gibt es eine Menge Konfigurationsoptionen. Solange Ihre Zellen mit Trypanblau gefärbt werden können (es ist lange her, dass ich mich mit Bakterien beschäftigt habe, verzeihen Sie meine Unwissenheit), um die Lebensfähigkeit zu untersuchen, sollte diese Maschine recht gut funktionieren. Bei Einstellung auf „ Maximum “ (dh die Analyse dauert so lange wie möglich) erhalte ich Ergebnisse in weniger als 4 Minuten pro Probe – und dazu gehört etwa eine Minute, bis sich die Probe in der Durchflusszelle abgesetzt hat. Wenn Sie die Empfindlichkeit verringern, erhalten Sie schneller Ergebnisse.
Grundsätzlich funktioniert es so, dass Sie 300 μl Ihrer Flüssigkultur (verdünnt, wenn Sie denken, dass die Konzentration zu hoch ist) nehmen und in ein Probengefäß geben. Stellen Sie alle Ihre Becher in das Tablett, füllen Sie die Probeninformationen und Analyseoptionen im MultiRun-Bildschirm aus und klicken Sie auf Start. Das Gerät enthält alle Reagenzien an Bord, mischt also das Trypanblau mit Ihren Proben und injiziert dann die richtige Menge in eine Durchflusszelle. Man lässt die Probe absetzen, dann wird ein hochauflösendes Bild der gesamten Länge der Durchflusszelle aufgenommen. Dann wird, abhängig von Ihren Empfindlichkeitseinstellungen, eine bestimmte Anzahl von Frames aus dem Vollbild genommen und analysiert. Aus allen Bildern wird dann ein Durchschnittswert gebildet und Ihre endgültigen Zahlen ausgespuckt. Anschließend können Sie einen Bericht über Zellzahlen und Lebensfähigkeit drucken oder speichern.
Die Software wird auch mit einigen Analysetools geliefert. Wenn Sie also mehrere Kulturen mit unterschiedlichen Wachstumsbedingungen im Laufe der Zeit betreiben, können Sie die Daten für jede einzelne aggregieren und Diagramme zu Zellzahlen, Lebensfähigkeit, Zellgröße usw. erstellen - es gibt sie mindestens 10 oder 20 Parameter zur Auswahl. Alle Bildanalyseoptionen sind konfigurierbar. Wenn Sie sich also die Ergebnisse ansehen und der Meinung sind, dass das Gerät zu viele tote Zellen oder nicht genug auswählt, können Sie die Parameter nach Ihren Wünschen ändern und die Optionen als benutzerdefinierten Analysetyp speichern.
Eine Option, die ich mag, die die KBE-basierte Zählung (neben der drastisch reduzierten Zeit) in die Hose schlagen würde, ist die Tatsache, dass die Maschine die Aggregation der Zellen erkennen kann. Ein Problem mit CFUs ist, dass es manchmal schwierig ist zu wissen, dass eine bestimmte Kolonie wirklich aus nur einer Elternzelle hervorgegangen ist – wenn Sie die Kolonien lange genug wachsen lassen, können Sie es vielleicht anhand der Größe erkennen, aber es ist eine schwierige Entscheidung. Da der Cedex die Zellen selbst betrachtet, spielt es keine Rolle, ob sie aggregiert sind oder nicht, da sie alle gezählt werden (vorausgesetzt, das Aggregationspartikel enthält keine große Menge an Zellen, z. B. 50+). kann von der Software aufgrund von Okklusion des Bildes nicht aufgelöst werden).
Ich weiß nicht, wie viel diese Typen kosten, also sind Sie abhängig von Ihrem Budget vielleicht nicht auf dem Markt für einen, aber wenn Sie viel zählen müssen, dann ist einer von diesen von unschätzbarem Wert. Ich bin mir sicher, dass andere Unternehmen ähnliche Instrumente herstellen, aber ich habe sie nicht verwendet, daher weiß ich nicht, wie sie im Vergleich zu HiRes abschneiden. Ich weiß, dass die Person in meiner Firma, die für den Kauf der HiRes verantwortlich war, sehr gut darin ist, mögliche Alternativen zu recherchieren, also ist diese wahrscheinlich so nah an der Spitze der Linie, wie wir sie für unsere Bedürfnisse finden konnten.
Viel Glück beim Zählen!
Ein Unternehmen namens HemoGenix bietet einen CFU-Alternativen/Ersatz-Assay an. Es heißt HALO PCA (Progenitor Cell Alternative). Wir haben es mit großem Erfolg eingesetzt. Dafür braucht es aber ein Instrument. Wir verwenden einen Biolumineszenz-Plattenleser, aber es sieht so aus, als hätten sie auch Kits für die Fluoreszenz- und Absorptionsanzeige.
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