LCMS/MS versus Western Blot

Ich habe eine allgemeine Frage, welche Methode Sie mir empfehlen würden, wenn ich den Unterschied im Gehalt mehrerer Proteine ​​in Gewebeproben untersuchen und verschiedene Behandlungsgruppen vergleichen möchte. Ich könnte entweder eine LCMS/MS oder einen Western Blot machen. Welche würden Sie empfehlen und würden Sie beides zur Validierung tun? Ich suche nach zeit- und kosteneffektiven Techniken. Ich freue mich über Anregungen. Danke!

Wie würden Sie das Gewebe für LCMS/MS vorbereiten? Das Auslesen würde total nach Müll aussehen. Es gibt alle möglichen Tricks für Western Blot, mit denen Sie ein genaues Maß erhalten könnten. Ich persönlich würde einen ELISA durchführen, um zu quantifizieren, wie viel Protein Sie tatsächlich haben.
Welche Quantifizierung benötigen Sie, absolut, relativ oder halb? Normalerweise würde eine Halbquantifizierung ausreichen.

Antworten (3)

Western Blot ist zwar eine häufig verwendete Technik und relativ einfach durchzuführen, hat jedoch einige Probleme:

  • Niedriger Durchsatz: Es ist schwierig, mehrere Proteine ​​gleichzeitig zu analysieren
  • Eingeschränkte Kreuzvergleichbarkeit: Da Antikörper gegen verschiedene Proteine ​​unterschiedliche Affinitäten haben können, können sie nicht miteinander verglichen werden.
  • Geringe Empfindlichkeit
  • Nicht sehr quantitativ

LCMS adressiert alle oben genannten Einschränkungen des Western Blot. Es ist auch möglich, gezielte Proteomik zu betreiben , dh statt des gesamten Proteoms nur einige wenige Proteine ​​zu untersuchen. Ein LCMS-System hat hohe anfängliche Einrichtungskosten, aber relativ niedrigere Betriebskosten. Das Massenspektrometer muss jedoch gewartet werden, und es ist keine leichte Aufgabe; Sie benötigen im Grunde eine Einrichtung und ein dediziertes technisches Personal.

Welche würden Sie empfehlen und würden Sie beides zur Validierung tun?

Welche Technik Sie verwenden sollten, hängt davon ab, was Sie wirklich sehen möchten und welche Ressourcen Sie zur Verfügung haben. Es ist ein allgemein praktizierter Ansatz, einen Western Blot zur erneuten Validierung einiger ausgewählter Gene durchzuführen, die aus dem LCMS-Experiment identifiziert wurden, um zu beweisen, dass das Ergebnis auch mit einer anderen Technik erhalten werden kann.

Obwohl quantitative Methoden unter Verwendung von MS entwickelt wurden, ist MS nicht von Natur aus quantitativ. Die Quantifizierung mit MS könnte ziemlich schwierig sein. Daher ist es nicht die erste Wahl. Wenn Sie jedoch nicht wissen, welche Proteinspiegel sich ändern, und Proteine ​​finden möchten, deren Expressionsspiegel in Ihren zu vergleichenden Proben unterschiedlich sind, ist MS keine schlechte Idee. In diesem Fall ist eine Validierung erforderlich. Mit anderen Worten, MS wird nicht verwendet, um WB-Ergebnisse im Allgemeinen zu validieren.

In Ihrem Fall wissen Sie, welche Proteine ​​Sie sehen möchten. Daher würde ich WB vorschlagen. Dies ist ein direkterer Weg. Eine Validierung von WB ist möglicherweise nicht erforderlich, aber es ist besser, einige unterstützende Daten zu erhalten: die Proteinaktivitäten in Lysaten, mRNA-Spiegel usw.

MS =Massenspektrometrie ; der Name selbst impliziert eine Quantifizierung. Wenn Sie sagen, dass es nicht so quantitativ ist, womit vergleichen Sie es?
Peptide werden ionisiert, um die Masse zu bestimmen, und die Ionisationseffizienz ist nicht vorhersagbar. Dies würde von Peptidsequenzen und wahrscheinlich Umgebungen, die Peptide umgeben, abhängen. Ich denke, das Wort Spektrometrie wird in MS verwendet, weil man das Spektrum der Molekülmasse sehen kann.
Ionisierungs- und Fragmentierungstechniken sind ziemlich standardisiert. Alle Quantifizierungstechniken leiden unter einer gewissen Verzerrung. Western Blot leidet auch unter Vorurteilen.
Western Blotting und Massenspektrometrie haben jeweils ihre Vor- und Nachteile. Wenn Sie eine gezielte Analyse eines bestimmten Proteins durchführen und Antikörper zur Verfügung haben (insbesondere im Handel erhältliche Antikörper), würde ich vorschlagen, einen Western Blot durchzuführen. Dies ist eine viel ältere Technik und die Leute fühlen sich wahrscheinlich wohler damit. Meiner Meinung nach ist es auch viel beruhigender, relative Dichten auf einem Blot visuell vergleichen zu können, als sich die Massenspezifikationsausgabe anzusehen.
@VanceAlbaugh Der einzige Vorteil von Western Blot ist, dass es einfacher ist und die meisten Leute sich damit wohl fühlen. Wie Sie sagten, ist es sicherlich kostengünstig und einfach, wenn nur wenige Proteine ​​untersucht werden sollen. Aber auch in diesem Fall sind Quervergleiche schwierig. Antikörper-Protein-Wechselwirkungen für verschiedene Paare sind nicht vergleichbar. Es kann viel mehr voreingenommen sein als Fragmentierungs-/Ionisationsvoreingenommenheit bei MS.
@ WYSIWYG-Ionisationseffizienzen für fragmentierte Peptide variieren ebenfalls sehr stark. Ich denke, dies erschwert auch Quervergleiche.
@WYSIWYG Obwohl Ionisationstechniken standardisiert sind, wäre der Vergleich zweier Proben schwierig, wenn MS auf die gleiche Weise, aber separat durchgeführt wird. Selbst wenn die Lösung zur gleichen Zeit von LC eluiert wird, scheint die Ionisationseffizienz zu variieren. Um dies zu verbessern, werden beide Proben gemischt, um sie in derselben Lösung zu analysieren. Ich schreibe es in den nächsten Kommentar.
Um dies zu verbessern, werden beide Proben gemischt, um sie in derselben Lösung zu analysieren. Auf diese Weise ist alles genau gleich, außer aus welcher Probe die Peptide stammen. Um Peptide aus welcher Probe zu erkennen, müssen Proben markiert werden. Die Markierung stabiler Isotope führt metabolisch zu mehreren Molekülmassenverschiebungen (oder je nach Isotop und wie vielen Atomen) Massenverschiebungen). Dies macht den Vergleich zuverlässiger. Es gibt andere Arten der Kennzeichnung, aber sie scheinen weniger quantitativ zu sein.
Was ich sagen will, ist, dass Western Blot trotz aller möglichen Probleme, die Sie erwähnen, viel unzuverlässiger ist als MS. Bei MS kann die Ionisationseffizienz variieren, aber es gibt Möglichkeiten, mehrfach geladene Spezies zu erkennen (dies hängt auch von der Ionisationsmethode ab, und IMO hat nur ESI eine hohe Wahrscheinlichkeit, mehrfach geladene Spezies zu erzeugen). Im Westen gibt es keine Möglichkeit, zwei Antikörper zu vergleichen, es sei denn, Sie erstellen eine Standardkurve (was meiner Meinung nach niemand tut).
@WYSIWYG (was meiner Meinung nach niemand tut)> Das liegt daran, dass sie es nicht für notwendig halten. Denn unterschiedliche Proteine ​​haben unterschiedliche Aktivitäten. Ein Vergleich der tatsächlichen Mengen zwischen verschiedenen Proteinen ist weniger informativ, es sei denn, Sie untersuchen die Stöchiemie von Komponenten in einigen Proteinkomplexen. Selbst wenn Zelllysate Proteinkomplexe enthalten und Sie eine der Komponenten sehen möchten, können Zellen die Komplexe aufgrund einiger Vorschriften nicht bilden.
@WYSIWYG (Bei MS kann die Ionisationseffizienz variieren, aber es gibt Möglichkeiten, mehrfach geladene Spezies zu erkennen> Ok, dann ist hier meine Frage. Warum müssen Wissenschaftler dann verzweifelt Quantifizierungsmethoden entwickeln, die stabile Isotope usw. verwenden?
Western Blot ist eine alte Technik. MS wurde erst vor relativ kurzer Zeit für die Proteomik entwickelt, so dass noch viele Fortschritte im Gange sind. Die Markierung mit stabilen Isotopen hilft bei der Unterscheidung von Proben, die im selben Lauf quantifiziert wurden (Test vs. behandelt). Zumindest weiß ich, dass dies für SILAC und ITRAQ gilt. Ich sagte, dass eine Standardkurve für WB notwendig ist, weil es keine Möglichkeit gibt, zwei verschiedene Antikörpermarkierungen aus demselben Blot zu vergleichen. Das entwickelt sich zu einer riesigen Diskussion und vielleicht sollten wir das im Chat besprechen.
Danke für deine Antworten. Ich habe also Zugriff auf beide Techniken, für LCMS gibt es einen geschulten Techniker, der alle Probleme lösen könnte, die sich aus dem Verfahren ergeben. Es ist noch nicht klar, ob es besser wäre, das eine oder das andere oder unbedingt beide zu verwenden. Ich muss Änderungen in Zielproteinen erkennen, aber es wäre auch schön, Änderungen in anderen unbekannten Proteinen zu sehen. Mit LCMS könnte ich das also erreichen, aber wäre es notwendig, es mit Western Blot zu bestätigen? Danke!
Viele Menschen verwenden LCMS für umfassende, erschöpfende Proteomanalysen und bewerten die Ergebnisse dann auf andere Weise. Besonders WB ist für diese Einschätzung beliebt. Bei der MS-Datenverarbeitung sind verschiedene Schritte involviert, da die Abdeckung von Peptiden nicht 100 % ist, einige Proteine ​​dieselben Peptide teilen und Modifikationen die Peptididentifizierung stören. Ich würde sagen, MS ist nicht einfach. WYSIWYG kann den Weg kennen, der nur MS verwendet. Sie könnten auch die Leute in der Einrichtung, die Sie nutzen werden, fragen, ob die Fähigkeit der MS dort zufriedenstellende Ergebnisse erzielen könnte, nur MS zu veröffentlichen.
Wenn Sie bioinformatische Analysen mit ganzen Daten durchführen, müssen Sie nicht alle Proteine ​​bewerten. Aber vielleicht möchten Sie mehrere aufheben, um zu zeigen, dass die MS gut funktioniert.
@Mary Es ist gut, die Ergebnisse mit einer anderen Technik zu bestätigen, und ich denke, es gibt keine andere Technik, die beliebter / einfacher zu handhaben ist als Western. MS ist datenintensiv und das Erstellen von Replikationen wäre zeitaufwändig. Sie können mehrere Replikationen in WB durchführen. Die allgemeine Idee ist also: LCMS durchführen → wichtige Proteine ​​identifizieren → WB für sie durchführen.
@243 Ich widerspreche dir nicht. Die MS-Analyse hat Probleme und es werden neue Algorithmen für eine bessere Zuverlässigkeit entwickelt. Was ich sagen will, ist, dass WB nicht unbedingt die Probleme anspricht, die MS hat. Der einzige Vorteil ist, dass es einfach durchzuführen ist (manchmal kann das auch problematisch sein, wenn Sie die Antikörper nicht haben).
@Mary Wenn Sie Ihre Antwort gefunden haben, akzeptieren Sie sie bitte. Im Allgemeinen können Sie einen Beitrag positiv bewerten, wenn Sie ihn nützlich finden. (Überprüfen Sie die Schaltflächen oben links in den Beiträgen)

Der beste Weg ist, FPLC zu verwenden, wenn Sie wissen, nach welcher Art von Protein Sie suchen. Falls Sie nicht wissen, wonach Sie suchen, können Sie eine 2D-PAGE ausführen und nach der Analyse von Spots dann LC MS verwenden. MS, um Ihre Proteine ​​zu identifizieren und dann mit FPLC fortzufahren (fürs Protokoll, FPLC ist eine HPLC- oder LC-Methode, die proteinfreundlich ist und sogar Sie verwenden können, um Ihr ausgewähltes Protein zu isolieren und zu reinigen)

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