Ich verwende ImageJ, um Western Blots zu analysieren. Ich habe Filme als Graustufenbilder eingescannt, weil wir das in meinem alten Labor so gemacht haben. Die Leute in meinem derzeitigen Labor sind mit dieser Erklärung nicht zufrieden und denken, ich sollte die Verwendung von Farbbildern in Betracht ziehen. Ich habe nach Protokollen gesucht, aber sie scheinen sich alle mit der Verwendung des Programms zu befassen, nachdem Sie einige Filme gescannt haben.
Kann mir jemand helfen, herauszufinden, welche Überlegungen bei der Auswahl, wie ich meine Filme scanne, einfließen?
Es gibt keinen Beweis dafür, dass das eine besser ist als das andere, höchstwahrscheinlich, weil es von Fall zu Fall unterschiedlich ist. Weder Sie noch Ihre Kritiker haben recht. Es gibt ein kleines bisschen Wissenschaft in einem Artikel über die Digitalisierung von Blots, die Verallgemeinerung von Blots eines bestimmten Proteins (PMID: 19517440), und sie verwenden ohne ersichtlichen Grund Graustufen. Kommen Sie zu dem Schluss, dass dies das beste Papier auf dem Gebiet der Immunoblot-Quantifizierung ist, und es fehlen immer noch Beweise.
Immunoblot ist halbquantitativ, was bedeutet, dass es Banden (und Proteinmengen) sortieren und ordnen kann, aber es scheitert oft beim Schätzen von Unterschieden und Verhältnissen und kann sogar Unterschiede nicht erkennen. Versuchen Sie einfach Ihr Bestes, um einen Unterschied zu finden, in dem Wissen, dass, wenn es keinen Unterschied in den Proteinmengen gibt, jegliches Hantieren mit dem Kontrast keinen Unterschied in der Quantifizierung der Banden erzeugen wird.
Es gibt fast keinen Unterschied zwischen farbigen und schwarz-weiß digitalisierten Bildern eines Immunoblots. Die schwarzen Teile des Flecks erscheinen im Computer immer noch als Weiß = 0, obwohl eine dreifarbige Bilddatei sie mit Rot = 0, Grün = 0, Blau = 0 detailliert. Die Teile, die fast schwarz sind, werden es tun immer noch sehr nahe bei Null sein.
Das einzige, was zwischen RGB und Farbe stark wechselt, ist der Hintergrund. Der Hintergrund kann sich beispielsweise von Weiß = 200 zu Rot = 190, Grün = 190, Blau = 220 ändern. Es gibt eine Folge eines solchen Umschaltens zwischen Werten für den Hintergrund. (Diese Änderungen können durch Umschalten zwischen Graustufen und RGB, aber auch durch Ändern der Belichtungszeit usw. hervorgerufen werden.) Wenn Sie eine Methode verwenden, bei der der Hintergrund den Blots zu nahe kommt, die "Amplitude" der Blots, die Höhe der Spitzen in ImageJ, wird reduziert. Dieser Kontrastverlust sollte einige der Unterschiede zwischen Blot-Banden auswaschen und die Unterstützung für Unterschiede zwischen Banden (dh für die alternative Hypothese) verringern, wodurch Sie einen echten Proteinunterschied verpassen.
Wenn Ihre Blot-Bänder unterschiedlich genug sind, so dass Ihre prozentuale Zunahme / Abnahme enorm und Ihr p-Wert klein ist, sind Sie unabhängig von der gewählten Methode fertig. Bitten Sie Ihre Kritiker, Ihre beobachteten Unterschiede anders als durch Proteinunterschiede zu erklären. Aber wenn Ihre Quantifizierung den p-Test nicht besteht, wird es meiner Meinung nach ein ehrlicher Versuch sein, die Farbe von Graustufen in RGB oder umgekehrt zu ändern, nur für den Fall, dass Ihre erste Wahl diejenige war, die den Kontrast dämpft.
Chris
Benutzer137