Rezept für Hochstrom-(Geschwindigkeits-)Übertragungspuffer

Kennt jemand eine effektive Puffermischung, die für westliche Übertragungen mit hohem Strom verwendet werden kann? Wir verwenden den vorgemischten Puffer des Anbieters erfolgreich, um eine breite Palette von Proteingrößen bei 1 A/25 V für 10 Minuten auf PVDF-Membranen zu übertragen. Mit dem teuren Puffer des Anbieters erzielen wir großartige Ergebnisse.

Ich habe kein nicht-proprietäres Rezept gefunden, das funktioniert. Die besten, die wir haben, halten die 25 V, haben dann aber eine Abnahme der Leitfähigkeit (Zunahme des Widerstands), wo sie bei 1 A beginnen, aber bis zum Ende der 10 Minuten auf 0,4 A abfallen. Der Puffer des Anbieters scheint den hohen Strom zu halten und führt zu besseren Übertragungen.

Ich weiß nicht, ob es hilfreich ist, alle Variationen, die ich ausprobiert habe, im Detail aufzulisten, aber sie drehten sich um die Modifikation eines traditionellen Towbin-Puffers plus SDS, mehr Glycin/Tris oder MgCl2. Dies waren alles verschiedene Vorschläge von Leuten aus der Abteilung, aber ich habe nicht viele veröffentlichte Beweise für einen Puffer unter diesen Bedingungen gefunden.

Mir ist klar, dass 1 A (und nein, ich meine nicht 1 mA) viel Strom ist, aber das System des Anbieters funktioniert wirklich gut. Alle Hinweise darauf, was ich versuchen/hinzufügen könnte, wären dankbar, auch wenn Sie kein ausgearbeitetes Protokoll haben.

Bearbeiten: Informationen aus dem MSDS zeigen an, dass es 3 Reagenzien enthält:

Listing of dangerous and non-hazardous components:
Proprietary Reagent K
10-20%
Proprietary Reagent EB II
5-10%
Proprietary Reagent S
1.0-2.5%
7732-18-5 water
50-100%
·
.....
Solvent content:
Organic solvents:
0.0 %
Water:
74.8 %
Solids content:
25.2 %

[Ich bin mir nicht sicher, ob diese MSDS-Informationen hier eingefügt werden sollten, nur weil ich jemanden suche, der bereits einen Hochstrompuffer verwendet hat, für den er die Formulierung kennt, keine Vermutung, was ich habe.]

In Bezug auf Nassübertragungspuffer kann ich Ihnen nicht helfen. Wenn es Ihnen nichts ausmacht, proprietäre Systeme zu verwenden, empfehle ich das iBlot-System (Invitrogen). Es handelt sich um einen Trockentransfer, der mit Nitrozellulose- oder PVDF-Membranen erhältlich ist und für einen vollständigen Transfer etwa 7 Minuten benötigt. Es mag teuer erscheinen, aber ich wette, es wird Ihnen auf lange Sicht Geld sparen.
@leonardo Ich glaube, obwohl Life Technologies (muss mit den Fusionen Schritt halten) iBlot als "trockenen Transfer" bezeichnen würde, scheint es wirklich wie ein halbtrockener Transfer mit sehr schönen vorverpackten Zellen zu sein. Ich habe sie verwendet, und die Gele schienen auf jeden Fall feuchter als trocken zu sein. Ich habe das Gefühl, dass Licor als Nicht-Spieler von Drittanbietern eine interessante Analyse hatte .
Ja, Life Tech ist jetzt die Muttergesellschaft. ;) Die Analyse ist interessant, aber ich würde aus dem Bericht schließen, dass iBlot eine ähnliche Leistung wie nasse und simi-trockene Transfermethoden hat. Die größte Verbesserung, die ich gefunden habe, war die größere Auflösung und Schärfe der Banden gegenüber manuell gegossenen SDS-Acrylamid-Gelen.
@leonardo, obwohl Sie mit vorgefertigten Gelen und der Standard-Nassübertragungsmethode von Towbin die gleiche Auflösung / Schärfe erhalten ...
@MattDMo Ich habe sicherlich viel Liebe für einen klassischen Towbin-Transfer, aber ich bin gerade an einem Ort mit hohem westlichem Durchsatz. Ich mache ungefähr 4 Gele und 16 Blots pro Tag durch Hochgeschwindigkeitslösungen (und bekomme gute Daten), ich hatte nur gehofft, einen Weg zu finden, um die Kosten zu senken.
@AtlLED - Ich verstehe, woher du kommst, ich habe nur versucht, Leonardos Kommentar zur Klarheit zu klären. FWIW, ich habe früher mindestens so viele Western pro Tag laufen lassen: Ich habe vorgefertigte Gele von Invitrogen verwendet und eine Nassübertragung bei 100 V (konstant) für 1 Stunde bei 4 ° C durchgeführt. Eines der Probleme, die wir beim iBlot gefunden haben, war seine Transfereffizienz von sehr kleinen/großen Proteinen – man kann das eine oder das andere bekommen, aber im Allgemeinen nicht beides.
Ich würde sowohl in das MSDS-Blatt als auch in das Patent schauen, falls vorhanden. Sie sollen Ihnen helfen, die Komponenten zu identifizieren, aber nicht das Rezept.
Schon gemacht. Verdeckt in der Propiatrie. Sogar gab es riesige Bereiche in was auch immer die mysteriösen Verbindungen waren.
hat jemand diesen Artikel gesehen? sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269713003230 Ich habe es versucht und es funktioniert!

Antworten (2)

Nach viel Arbeit in der Optimierung dachte ich, ich würde posten, was für mich am besten funktioniert. Dieses Pufferrezept war in der Lage, EGFR und Insulin erfolgreich aus dem gleichen Lysat zu übertragen, und eine klare Bande für beide (jeweils großes und kleines Protein). 10 % SDS-PAGE-Gele wurden bei 1A für 10 min übertragen.

Hochstrom-Übertragungspuffer

  1. 48 mM Tris
  2. 15 mM HEPPS
  3. 1,0 mM EDTA
  4. 1,3 mM NaHSO3
  5. 1,3 mM N,N-Dimethylformamid
  6. 25 mm gLY-GLY
  7. 20 % Methanol (Vol./Vol.)

Ich hoffe, dass dies jemand anderem helfen kann, und möchte Garic et al. als wunderbaren Ausgangspunkt nennen. Ihre Veröffentlichung erfolgte, nachdem ich die Frage gestellt hatte, wie @user4148 betonte.

Den SB-Puffer gibt es schon eine ganze Weile, und ich habe ihn definitiv schon seit einiger Zeit erfolgreich sowohl für Agarose- als auch für PAGE-Gelpuffer verwendet. Die einzige Sache ist, dass Sie das Gel in einem kalten Raum laufen lassen müssen (hohe Spannung entspricht hoher Temperatur) und dass Sie das Timing und die Bedingungen optimieren müssen, damit Ihre Proben nicht vom Gel ablaufen.

Ich habe SB verwendet. Erstens ist es kein Laufpuffer, kein Übertragungspuffer (oder zumindest habe ich noch nie davon gehört, dass er bei der Übertragung verwendet wird), zweitens glaube ich, dass die Formulierung immer noch etwas breit ist, nein?
Wenn Sie sich das Laufpufferrezept ansehen, enthält es SDS, während der Transferpuffer Methanol enthält. Unter Verwendung des gleichen Basispuffers, aber Hinzufügen des anderen Reagenz, habe ich es zuvor verwendet. Möglicherweise müssen Sie es jedoch mit Ihrem spezifischen Rezept und Ihren Laufbedingungen ausprobieren, um es zu optimieren.
Mein Punkt war nicht, dass ich keine SB-Rezepte finden konnte, mein Punkt war, dass ich mehrere finden konnte. Ich werde das verlinkte ausprobieren und sehen, wie es zur Optimierung steht. Ich kann immer noch keine Beispiele für SB in Hochstrom-Niederspannungssituationen finden (insbesondere für den Proteintransfer). Der, den Sie verlinkt haben, notiert 25 V o / n, was das Gegenteil von dem ist, was ich versuche.
Ich weise nur darauf hin, dass es auch für Transferpuffer verwendet werden kann. Aber interessante Leute scheinen gemischte Erfahrungen damit zu haben. Ich denke, im Allgemeinen möchten Sie wahrscheinlich keine schnellen Übertragungen durchführen, wenn Sie nach sehr präzisen oder genauen Ergebnissen suchen, da dies im Allgemeinen ein Kompromiss ist, den Sie berücksichtigen müssen.
Ah, aber das Problem ist, dass ich mit dem Puffer des Anbieters sowohl präzise als auch genaue Ergebnisse erhalte. Ich habe es direkt mit einem langsamen Tanktransfer über Nacht verglichen.
Wahrscheinlich, weil sie viel Zeit und Geld in die Optimierung des Produkts investiert haben. Viele der proprietären Rezepte und Protokolle sind nicht mehr oder weniger kompliziert, nur besser optimiert, denke ich ...
Ja, ich glaube nicht, dass ein SB-Puffer funktionieren wird. Ich habe mehrere Formulierungen ausprobiert, und alle schnitten weitaus schlechter ab. Manche haben sogar gekocht.
Rezept für Hochstrom-(Geschwindigkeits-)Übertragungspuffer
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v