Die Frage ist ziemlich einfach: Beeinflusst Formaldehyd- oder Methanol-Fixierung in Vorbereitung auf die Immunzytochemie/Immunfluoreszenz-Färbung den pH-Wert der Lysosomen?
Etwas Hintergrund: Ich versuche, den intrazellulären Transport eines fluoreszenzmarkierten lysosomalen Enzyms zu untersuchen. Zellen werden in vitro gezüchtet und mit dem markierten Protein behandelt, das über rezeptorvermittelte Endozytose in die Zellen aufgenommen wird . Der Protein-Rezeptor-Komplex zielt auf den späten Endosom-Lysosom-Weg ab, wo schließlich der saure pH-Wert des Lysosoms dazu führt, dass die beiden dissoziieren und der Rezeptor recycelt wird, während das Enzym bleibt und seine Sache tut. Ich habe das Enzym mit zwei verschiedenen Farbstoffen markiert – Alexa Fluor 488, das angeblich pH-unempfindlich zwischen 4 und 10 ist, und pHrodo Red, das eine stark erhöhte Fluoreszenz aufweist, wenn der pH-Wert fällt. Alexa488 ist der hellste der Alexa-Farbstoffe und wird häufig in allen möglichen Anwendungen eingesetzt. pHrodo ist nicht so hell (soweit ich das beurteilen kann, war es schwierig, Vergleiche zu finden), aber seine pH-Abhängigkeit hilft, den Effekt der unspezifischen extrazellulären Bindung zu verringern, und es scheint bisher in meinem System zu funktionieren.
Also, was ist das Problem? Ich entwickle einen Assay, der die Fähigkeit bestimmter Substanzen misst, die Aufnahme dieses Enzyms in die Zelle zu blockieren. Da ich einen Signalmangel messen werde, ist es umso besser, je höher ich das ungehemmte Signal erreichen kann. Wie ich schon sagte, pHrodo funktioniert gut, aber es könnte besser sein. Das Problem ist, dass mein Alexa-markiertes Protein ein extrem niedriges Signal-Rausch-Verhältnis hat, obwohl ich genau das Gegenteil erwartet hätte. Ich frage mich, ob der Alexa-Farbstoff in meinem System wirklich etwas pH-empfindlich ist und im sauren Lysosom nicht so gut fluoresziert. Ich stoße auch auf ein paar andere Probleme, und während ich, bevor ich Live-Cell-Imaging durchführte, anfange, mit dem Gedanken zu spielen, zuerst die Zellen zu reparieren,
Daher meine Frage: Beeinflusst das Fixieren der Zellen mit 4% Formaldehyd in PBS (Standard-ICC/IF-Protokoll) den pH-Wert der Lysosomen? Würde die Methanolfixierung dasselbe bewirken? Irgendwelche anderen Vorschläge zum Erhöhen des Signals?
Meiner Meinung nach sollte die Zellfixierung den pH-Wert nicht verändern. Ungepuffertes Formalin oxidiert jedoch und senkt den pH-Wert, aber die Verwendung von PBS sollte den pH-Wert um etwa 7 puffern. Vielleicht wäre auch eine Glutaraldehyd-Fixierung eine Option, wenn die anderen nicht funktionieren ...
Ich fand diese Website von Leica sehr nützlich, vielleicht hilft sie Ihnen auch:
Ja, beide beeinflussen den pH-Wert.
Zusätzlich zu dem obigen Kommentar dehydrieren beide, aber insbesondere Methanol, Proben - die Entfernung von Wasser wird den pH-Wert in Organellen definitiv beeinflussen. Dies wird zeitabhängig sein. Sowohl die Dauer der Fixierung als auch die Zeit nach der Fixierung, bevor Sie die Zellen beurteilen, beeinflussen den pH-Wert der Organellen.
Da Sie die Zellen in einer nichtwässrigen Umgebung fixieren (ich nehme an, Sie verwenden die Standardfixierung), verwenden Sie während der Fixierung keinen Puffer. Wir können möglicherweise besser antworten, wenn Sie das allgemeine Protokoll veröffentlichen, dem Sie folgen.
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Benutzer4739