RNeasy Mini Kit niedriges 260/230-Verhältnis – kann ich diese RNA für die weitere Verwendung aufreinigen?

Ich habe das RNeasy Mini Kit von Qiagen verwendet, um RNA aus 5*10^5 C28/I2 (immortalisierte menschliche Chondrozyten) zu isolieren. Meine Ausbeute ist jedoch niedrig (~25 ng/ul), aber mein 260/280-Verhältnis ist großartig (~2,3) und mein 260/230-Verhältnis ist tragisch (~0,06). Ich habe die Spin-Säule bereits weggeworfen, aber ich würde gerne wissen, 1) ob ich mein 260/230-Verhältnis für die 40 ul RNA, die ich extrahiert habe, erhöhen könnte, und 2) ob ich die RNA so aus der Lösung präzipitieren könnte eine konzentriertere Lösung herstellen.

Bitte lassen Sie mich wissen, wenn weitere Details erforderlich sind.

Danke!

Sie können die RNA einfach mit Ethanol oder Isopropanol präzipitieren. Ich würde vorher auch eine Phenol-Chloroform-Extraktion machen. Aber ist das sinnvoll? Wenn Sie mit einer Zelllinie arbeiten, würde ich lieber eine frische Präparation machen, als Zeit und Geld zu verschwenden, um die RNA von schlechter Qualität aufzubewahren.
Diese Zellen wachsen sehr langsam und ich habe eine einfache PCR, die ich in den nächsten Tagen durchführen muss, also würde ich sie am liebsten verschonen. Ich hatte diese Probleme einfach noch nie. Wie präzipitiere ich die RNA mit Ethanol?
Haben Sie die Menge des RLT-Puffers im Qiagen RNAeasy Minikit geändert? Wenn ja, wie viel hast du verbraucht?

Antworten (1)

Das RNAeasy-Kit verursacht normalerweise keine phenolische Kontamination. Deine schlechte 260/230 liegt vielleicht an der geringen Ausbeute; Überprüfen Sie die absoluten Extinktionswerte. Niedrige 260/230 (und niedrige Ausbeute) treten auch wegen unsachgemäßer Lyse auf. Ich würde Ihnen raten, die Zelllyse mit effektiveren Methoden durchzuführen. Ich würde keinen weiteren Phenol-Chloroform- oder Alkoholpräzipitationsschritt empfehlen - Sie werden Ihre RNA verlieren. Führen Sie mit dem, was Sie jetzt haben, ein wenig über das Gel, um die Integrität zu sehen. Versuchen Sie auch, die gelöste RNA 10-15 Minuten lang auf 65-70 Grad zu erhitzen, und messen Sie die OD erneut (verwenden Sie Nanodrop oder ein ähnliches Gerät).

Das niedrige Verhältnis von 260/230 weist meines Erachtens auf eine Kontamination mit Guanidin hin. Der RNeasy "RLT-Puffer" enthält meines Wissens Guanidin.
Es tut. aber die säulenbasierte Reinigung hinterlässt diese Verunreinigungen im Allgemeinen nicht.
Wie hast du sie lysiert? WYSIWYG ist hier wahrscheinlich etwas dran.
RNeasy Mini Kit niedriges 260/230-Verhältnis – kann ich diese RNA für die weitere Verwendung aufreinigen?
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