Als Antwort auf meine vorherige Frage habe ich mich ein wenig über Poly - D -Lysin, Kollagen I, Kollagen IV, Laminin und andere Gewebekulturbeschichtungen informiert, die die Zelladhäsion fördern. Ich bin immer davon ausgegangen, dass alles andere als standardmäßiger TC-behandelter Kunststoff oder Glas den Hintergrund erheblich erhöhen würde, aber vielleicht sind meine Ansichten zur Hintergrundfluoreszenz etwas veraltet. Hat jemand Erfahrung damit in einer Fluoreszenzmikroskopie/Hochdurchsatz-Screening-Umgebung?
Speziell in meinem Fall betrachte ich die Endozytose und den Transport eines markierten Proteins in das Lysosom . Ich markiere das Protein mit dem pH-abhängigen Farbstoff pHrodo TM von Molecular Probes, der angeblich bei neutralem pH sehr wenig fluoresziert, aber sehr hell wird, wenn der pH-Wert fällt, wenn endozytische Vesikel zu Lysosomen werden. Theoretisch bedeutet dies, dass kein abschließender Waschschritt erforderlich ist, aber bei einer Matrixbeschichtung auf den Platten mache ich mir Sorgen um den Hintergrund.
Was ist also die aktuelle Meinung in Bezug auf die Hintergrundfluoreszenz der verschiedenen TC-Matrizen? Kommt der Hintergrund von der Matrix selbst oder von der Adsorption des Fluoreszenzfarbstoffs? Ist es wellenlängenabhängig? Glücklicherweise bleibe ich vielleicht nicht an meinen schlecht haftenden Zellen hängen, und ich brauche am Ende vielleicht überhaupt keine zusätzliche Matrix, aber ich möchte immer noch besser verstehen, wie es funktioniert.
Extrazelluläre Matrix (ECM) fluoresziert, insbesondere Kollagen und Laminin. Das Maximum liegt in den DAPI- und FITC-Kanälen und die Fluoreszenz wird zu längeren Wellenlängen hin schwächer. Da die Schicht auf den TC-Kolben jedoch sehr dünn ist, würde ich nicht erwarten, dass dies ein Problem darstellt. Am besten einfach ausprobieren. Es gibt auch ein ziemlich berühmtes Dokument, das hilfreich sein könnte: