Ich teste den Fluoreszenzpegel einer Probe mit dsDNA, SYBR Green und Milliq-Wasser, aber ich habe Schwierigkeiten bei der Auswahl des richtigen Volumens an dsDNA und des Cons-Levels von SYBR Green.
Details der Probe : dsDNA: 1000 Nanomol, SYBR Green: 1X (1000-fach verdünnt aus dem Originalbestand)
Probe_1 : dsDNA (3ul) + SYBR Green (5ul) + milliq Wasser (27ul)
Probe_2 : dsDNA (3ul) + SYBR Green (5ul)
Ergebnis : Im ersten Beispiel habe ich kein Signal, aber im zweiten Fall habe ich (aber ich möchte 5-mal höher als das, was ich habe).
Bitte sagen Sie mir, wie es funktioniert und wie diese Dinge voneinander abhängen. Ich bin kein Biologe, wenn möglich, schlagen Sie mir auch eine Ressource vor.
Ich musste online nachschlagen, fand hier aber schließlich eine wichtige Information: die Nachweisgrenzen von SYBR Green.
dsDNA bei 300 nm Durchleuchtung: 60 pg
Oligonukleotide bei 300 nm Durchleuchtung 1–2 ng
Sie sollten zuerst die Größe Ihrer interessierenden DNA überprüfen und anhand ihrer Größe das ungefähre Molekulargewicht ermitteln (z. B. mit diesem Online-Rechner ). Dann sollten Sie überprüfen, ob 1000 nmol Ihrer DNA einer Masse von mehr als 60 pg entsprechen. Wenn nicht, sollten Sie die DNA-Menge in Ihrem Assay entsprechend erhöhen, bis die in den Assay eingeführte Masse die Nachweisgrenze von SYBR Green überschreitet.
Nun, kennen Sie die Konzentration Ihrer DNA? Mit anderen Worten, wie haben Sie sich entschieden, 3 ul DNA zu verwenden? Woher wissen Sie, dass diese 3 ul genug Material enthalten? (1000 nmol wie in Ihrem Protokoll, oder besser, dass dies in Bezug auf die Masse höher als die Nachweisgrenze ist).
Haben Sie außerdem die 1000-fache Stammlösung von SYBR Green ohne Zwischenverdünnung verwendet? Wenn dies der Fall ist, ist die Endkonzentration von SYBR Green in beiden Proben viel größer als das endgültige 1X, das Sie möchten:
Was Sie brauchen, ist entweder 1 ul der 1000-fachen Stammlösung von SYBR Green + eine beliebige DNA-Menge, die über der Nachweisgrenze liegt, + Puffer, um das Volumen auf 1000 ul endgültig einzustellen (was SYBR Green auf 1-fach endgültig bringt) oder Nehmen Sie eine geeignete Zwischenverdünnung von SYBR Green vor, sodass die Endkonzentration 1X beträgt, indem Sie die in Ihrer Frage beschriebene Probenvorbereitung befolgen.
Die hier beschriebene Probenvorbereitung ergibt eine Zusammensetzung, die weit von der in Ihrem Protokoll vorgeschlagenen Zusammensetzung abweicht, zumindest für SYBR Green. Bevor Sie es noch einmal mit den richtigen Endkonzentrationen versuchen, schließen Sie nicht, dass es nicht funktioniert hat. :-)
Viel Glück mit Ihrem Projekt.