Gibt es neben der radioaktiven Markierung Methoden zur Nukleotidmarkierung, die mit der Verwendung zur reversen Transkription kompatibel sind und für die die regulatorischen Rahmenbedingungen in der EU / den USA zulässig sind? Regulatorische Auflagen rund um Radionuklide sind zu streng.
Biotin-markierte Nukleotide können durch reverse Transkriptase in cDNA eingebaut werden. Jena Bioscience, ein Anbieter von Biotin-markierten Nukleotiden, hat eine Tabelle , die zeigt, welche Nukleotidchemie erfolgreich mit reverser Transkriptase verwendet wurde, obwohl Sie sich in die Datenblätter bestimmter Produkte vertiefen müssen, um die Referenzen zu erhalten.
Eine Referenz auf der Produktseite für Biotin-11-dCTP:
APOBEC3G hemmt die Verlängerung von HIV-1 Reverse Transcripts
Diese Studie befasst sich mit der natürlichen endogenen reversen Transkription (nERT) bei HIV. Aus den Methoden:
Für diesen Assay wurde eine nERT-Reaktion im Wesentlichen wie oben durchgeführt, mit Ausnahme der dNTP-Zugabe: Pelletierte Virionen wurden in PBS, 2,5 mM MgCl 2 , 15 &mgr;g/ml Melittin und 0,5 mM Biotin-11-dCTP (Jena Bioscience) resuspendiert. und bei 37°C inkubiert.
Ja, Biotin ist eine nicht radioaktive Option, die zur Markierung von Nukleotiden verwendet wird. Verschiedene Enzyme, die zum Einbau dieses Biotin-markierten Nukleotids verwendet werden, sind: Taq-Polymerase für die Ploymerase-Kettenreaktion, DNA-Polymerase für die Nick-Translation, Reverse Transkriptase des Moloney Murine Leukemia Virus für die reverse Transkription, Klenow-Exonuclease für die Primerverlängerung und Terminale Desoxynukleotidyltransferase für die 3'-Endmarkierung.
Der Nachweis dieser Biotin-markierten Sonden erfolgt unter Verwendung von Streptavidin, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Agarose/magnetischen Kügelchen.
https://www.promocell.com/f/product-information/manual/PK-CA-BIO-DUTP-1000P.pdf )