DNA-Quantifizierung in einem Biolabor einer High School

Ich arbeite an einem Projekt in einem Biolabor einer High School (so begrenzte Ressourcen) und ich brauche eine Möglichkeit, die DNA-Konzentration in einem PCR-Produkt zu quantifizieren. Ich kann keine Spektrophotometrie verwenden (billige Spektralphotometer in der Schule können die Absorption bei 260 nm nicht messen), und fluoreszierende Farbstoffe kommen nicht in Frage, da wir keinen Transilluminator haben. Im Moment bin ich dabei, die Absorptionsänderung in einem Farbstoff für sichtbares Licht wie Kristallviolett oder Methylenblau zu messen, aber es gibt nicht genügend Daten zur Quantifizierung mit diesen Farbstoffen. Kann jemand etwas vorschlagen?

Vielen Dank.

Kannst du ein Gel laufen lassen?
Ja, obwohl Gelextraktionen etwas schwierig sein könnten.
Wenn Sie Glück haben und nicht viele Wiederholungsmessungen benötigen und es in Ihrer Stadt eine Universität gibt, können Sie sich an die Verwaltungsmitarbeiter (Achtung: keine Professoren) einer passenden Abteilung (z. B.: Genetik) wenden, die normalerweise die Stelle übernimmt Sie in Kontakt mit einem Doktoranden eines Experimentallabors stehen. Normalerweise helfen die Leute gerne bei "kleinen Problemen" wie diesen - und wenn jemand von einer High School kurz ein Labor besucht, ist das für alle Beteiligten gut, da dies ein nettes Zeichen für die Öffentlichkeitsarbeit ist.
Ich kenne einen Typen an einer nahe gelegenen Uni, der vielleicht bereit wäre zu helfen, aber da das Projekt offiziell benotet ist, bräuchte ich einen ziemlich guten Datensatz mit Replikaten, also würde es bedeuten, im Grunde alles an der Uni zu machen, was ich bin versuche vorerst zu vermeiden. Ich werde es jedoch für eine Backup-Option im Hinterkopf behalten.
Sie können DNA in einem Gel quantifizieren, indem Sie die Bandenintensität der unbekannten Probe mit der einer bekannten Masse vergleichen. Ich kann erläutern, ob dies eine vernünftige Strategie für Sie zu sein scheint.
Das klingt interessant, können Sie das näher erläutern?

Antworten (1)

Innerhalb eines gewissen linearen Bereichs ist die Intensität gefärbter DNA-Banden in einem Gel direkt proportional zu ihrer Masse. Indem eine Standardkurve aus Banden bekannter Masse erstellt wird, kann die Masse unbekannter Banden geschätzt werden. Dieser Vorgang wird als Densitometrie bezeichnet . Ich habe in dieser Antwort kurz über seine Verwendung bei der Quantifizierung von Proteinbanden nach SDS-PAGE geschrieben , aber ich werde näher darauf eingehen, wie dies mit dem folgenden mit Ethidiumbromid gefärbten Gel durchgeführt wird:

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Rechts ist ein Molekulargewichtsmarker (BstEII-Verdau von λ-DNA) mit Banden bekannter Masse. Auf der linken Seite sind zwei Banden unbekannter Masse (eigentlich ein doppelt geschnittenes Plasmid).

Ich verwende ein kostenloses Programm namens ImageJ , um Bandintensitäten abzuschätzen. Sie haben hier ein Tutorial zum Messen der Bandintensität . Sie können ImageJ auch mit Java (und vielen anderen Dingen) in der Software Fiji packen .

Öffnen Sie das Bild in ImageJ und verwenden Sie das RectangleWerkzeug, um einen Rahmen um die Markierung zu zeichnen, und wählen Sie dann Analyze > Gels > Select First Lane(oder die Verknüpfung Ctrl+1). Ziehen Sie als Nächstes das Feld, um die andere Fahrspur zu umgeben, und wählen Sie Analyze > Gels > Select Next Lane( Ctrl+2). Wählen Sie nun Analyze > Gels > Plot Lanes( Ctrl+3), um die Bildintensität als Funktion der Position auf dem Gel darzustellen:

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Die Fläche unter jedem Peak (abzüglich des Hintergrundrauschens) repräsentiert die ungefähre Gesamtintensität für jedes Band. Um diesen Bereich zu messen, verwenden Sie das Linienwerkzeug ( Straight), um Grenzen an der Basis jedes Peaks zu zeichnen:

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Ich habe es hier etwas willkürlich gemacht, aber Sie bekommen die Idee. Klicken Sie nun mit dem Zauberstab-Werkzeug in jeden Peak und ImageJ tabelliert die integrierte Intensität von jedem. Unten sind die Intensitäten der Markierungsbänder (wobei das oberste Band Band 1 ist) sowie ihre Massen (die bekannt sind) dargestellt:

          Mass (ng)    Intensity
Band 1    45           5319.891
Band 2    28           3816.234
Band 3    24           3256.406
Band 4    16           2298.749
Band 5    15           2074.749
Band 6    8            1084.991

Nehmen Sie diese Daten in Excel (oder ähnliches) und zeichnen Sie die Intensität als Funktion der Masse auf. Band 1 scheint außerhalb des linearen Bereichs zu liegen und unterschätzt die Masse. Dies war eigentlich zu erwarten, denn wenn Sie sich die Bande im Gelbild genau ansehen, gibt es rote Pixel, die darauf hinweisen, dass sie übersättigt ist. Ignorieren Sie dieses Band und führen Sie für den Rest eine lineare Regression durch.

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Die Regression ergibt die Gleichung ich = 134,74 M + 53.988 mit R 2 = 0,9975 . Für die Masse neu anordnen, haben wir M = ich − 53.988 134,74 . Ermitteln Sie die Intensität der unbekannten Banden wie oben beschrieben und berechnen Sie ihre Masse mit der vorstehenden Gleichung:

          Mass (ng)    Intensity
Band 1    27           3736.991
Band 2    15           2125.284
Meine Erfahrung ist, dass dies eine viel sicherere Methode ist als (zum Beispiel) Nanodrop. Ich muss allerdings zugeben, dass ich die Quantifizierung in ImageJ/FIJI selten gemacht habe; Das Schätzen mit dem Auge war normalerweise für die meisten Anwendungen nahe genug :)
DNA-Quantifizierung in einem Biolabor einer High School
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