Ich amplifiziere ein Gen, bei dem ich in einer Gradienten-PCR eine Amplifikation bei einer Annealing-Temperatur erhalte, die etwa 5 Grad (67) höher als Tm (62,5) ist? Was ist hier falsch? Außerdem bekomme ich ein sehr starkes intensives Band mit falscher Größe für alle Temperaturen, die unter Tm versucht wurden. Bitte helfen
Es kommt sehr häufig vor, dass ein Glühen bei einer höheren als der vorhergesagten Tm erfolgt. Wenn dies in Ihrem Fall ein Problem darstellt, insbesondere wenn es bei niedrigeren Temperaturen zu Fehlanlagerung kommt, sollten Sie die Verwendung von Touchdown-PCR in Betracht ziehen , um eine optimale Temperatur zu finden. Oder ganz pragmatisch, wenn Sie beim Grundierungsdesign flexibel sind, bestellen Sie einfach einen Satz Grundierungen und probieren Sie sie alle aus. Grundierungen sind heute billig, und Sie werden oft ein Set finden, das funktioniert, selbst wenn die Designprogramme behaupten, dass dies nicht der Fall ist.
Die Tm der Primer würde nicht viel über die PCR-Bedingungen aussagen. Wenn Sie unspezifische Banden erhalten, lohnt es sich, eine höhere Temperatur zu versuchen.
Ihre Temp. versucht bereits nahe der Temp. zu verlängern, damit Shuttle-PCR zur Verfügung steht. Die Shuttle-PCR besteht aus nur 2 Schritten: 94 bis 96 Grad zum Schmelzen der DNA und 68 bis 74 Grad zum gemeinsamen Annealen und Verlängern.
Vielleicht möchten Sie DMSO oder Betain hinzufügen. Sie könnten helfen, Fehlglühen zu reduzieren. Wenn die unspezifischen Banden kleiner und länger sind als die erwarteten Banden, können längere bzw. kürzere Verlängerungszeiten zu besseren Ergebnissen führen.
Und denken Sie daran, dass das Design der Grundierung ebenfalls wichtig ist. Überprüfen Sie, ob Sie Sequenzen haben, die sich in Ihrer Vorlage wiederholen, und vermeiden Sie es, Primer aus solchen Sequenzen zu entwerfen.
In Bezug auf eine höhere Glühtemperatur als Tm verwende ich häufig T7-Primer, deren Tm 48,3 Grad beträgt. Die Grundierung funktioniert gut bei 55 Grad Glühtemperatur. Normalerweise sind Primer in PCR-Reaktionsröhrchen im Überschuss vorhanden, was das chemische Gleichgewicht in Richtung Annealing drängt. Das ist, was ich spekuliere.
Der TM der Grundierung wird auch von der Salzkonzentration Ihrer Mischung beeinflusst. Probieren Sie den PCR-Gradienten aus? Oder Sie versuchen die Berechnung von Tm und berücksichtigen die Salzkonzentration. http://www.biophp.org/minitools/melting_temperature/demo.php
AMR
AliceD