Nach Erhalt der rekombinanten DNA ist es üblich, in E. coli zu transformieren, um nach rekombinanter DNA zu suchen und diese zu amplifizieren. Aber ich möchte fragen, ob wir es mit PCR amplifizieren können?
Ich denke, es wird nach der Restriktionsligation 3 DNA-Moleküle geben:
Können wir, um nur das rekombinante Plasmid zu amplifizieren, Primer entwerfen, die sich über das Insertfragment und den Vektor erstrecken, die sich nur gut mit dem rekombinanten Plasmid paaren können, aber mit anderen Typen?
Ich weiß jedoch nicht, ob sich diese Einschränkung im Primerdesign auf GC% auswirkt. Ich überlege also, ob wir eine Phosphatasebehandlung durchführen können, um eine Selbstligation zu verhindern, und dann Exonuklease hinzufügen können, um die gesamte lineare DNA zu verdauen, dh letztendlich nur rekombinantes Plasmid zu behalten, damit die Einschränkung überwunden werden kann (da wir jetzt Primer an geeigneter Stelle auf rekombinantem Plasmid entwerfen können). ), darf ich fragen ob das gültig ist?
Nach der PCR wird das rekombinante Plasmid linearisiert (2 stumpfe Enden, die durch Vorwärts- und Rückwärtsprimer erzeugt werden, wenn ich das richtig verstehe?), Das wird weniger stabil, da es durch Exonuklease abgebaut werden kann. Können wir daher Ligase hinzufügen, um das Plasmid zu zirkularisieren? Können Ligasen 2 stumpfe Enden ligieren?
Ich weiß nicht, ob diese Methode durchgeführt werden kann, aber ich denke, wenn wir nach der Erzeugung rekombinanter Plasmide nur die DNA amplifizieren wollen (das Proteinprodukt nicht benötigen), ist dies nicht effizienter als die bakterielle Transformation?
Vielen Dank und bitte korrigieren, wenn ich Fehler gemacht habe.
Ich bin mir überhaupt nicht sicher, ob Sie den Prozess hier erkennen. Im Allgemeinen werden die Bakterien für die Amplifikation des Plasmids auf Niveaus verwendet, bei denen Sie es verwenden würden. Dies durch PCR zu tun ist technisch möglich, aber viel viel teurer, hat eine höhere Fehlerrate (aufgrund von fehleranfälligen DNA-Polymerasen) und erfordert zusätzliche Schritte. Sie werden auch nicht so viel DNA herausbekommen wie aus einer Bakterienkultur. Die Kultur ist auch skalierbar – Sie wollen mehr DNA, züchten Sie einfach mehr Bakterien. Sobald Sie ein Plasmid in einen Bakterienstamm umgewandelt haben, können Sie Vorräte davon bei -80 in Glycerinform lagern. Sie können dann ein wenig abkratzen, über Nacht wachsen lassen und am nächsten Tag ein <2-stündiges Verfahren durchführen und am Ende mehrere Mikrogramm sehr saubere DNA erhalten.
Ich empfehle Ihnen dringend, ein gutes Klonierungsprotokoll zu lesen, wie es in Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual oder Current Protocols zu finden ist . Klonen gibt es jetzt seit >50 Jahren, ich denke, der Prozess ist mehr oder weniger optimiert.
Der übliche Prozess zur Generierung eines Plasmids läuft folgendermaßen ab:
Die Bakterien verdauen die lineare DNA im Allgemeinen durch die Produktion exogener DNasen, und lineare DNA transformiert sich oft nicht gut, sodass Ihr Exo-Nuklease-Schritt unnötig ist.
Wenn Sie Kolonien screenen, verwenden Sie normalerweise Primer, die für das Insert spezifisch sind, oder, wenn Sie feststellen möchten, ob das Insert in einer bestimmten Ausrichtung eingefügt wurde, dann einen Primer auf dem Rückgrat und einen anderen auf dem Insert. Nur die Amplifikation von beiden Primern, die eine Bande der richtigen Größe erzeugt, ist ein positives Insert. In diesem Fall ist es möglich, Primer herzustellen, die nur solche Plasmide erkennen, die ein Insert aufweisen.
Es gibt einige Fälle, in denen Sie Primer generieren könnten, die das gesamte Insert umfassen – die Sequenzierung des gesamten Inserts könnte einer sein. Plasmide haben diese Art von Stellen oft bereits eingebaut. Wenn Sie etwas mit der Aufschrift M13 oder BGH sehen, sind dies übliche Stellen für die Sequenzierung von Primern. Eine weitere übliche Verwendung ist, wenn Sie eine Reihe von Inserts wünschen (z. B. Bibliotheksvorbereitung) und nicht wissen, wie groß die Inserts sein könnten, dann können Sie die Insert-übergreifenden Primer verwenden, um Plasmide zu identifizieren, die selbstligiert sind (kein Insert). da diese nur sehr kleine Produkte auf einem Gel produzieren. Es ist nicht möglich, Insert-übergreifende Primer herzustellen, die nur die Rekombinanten erkennen. Keine Ligation oder Exonukleasen erforderlich.
Ein weiteres mögliches Szenario besteht darin, dass Sie eine Base (oder mehr als 1) in einem bereits konstruierten Plasmid ändern möchten. Dies wird als ortsgerichtete Mutagenese bezeichnet . In diesem Fall möchten Sie, dass die PCR das gesamte Plasmid umgibt, und die elterliche DNA (aus dem Plasmid) wird durch den Verdau mit dem methylierungsspezifischen Restriktionsenzym DpnI beschädigt (PCR-Produkte werden nicht methyliert, aber bakteriell gezüchtete sind es normalerweise). und das eingekerbte kreisförmige Produkt, das von den Bakterien nach der Transformation repariert wird.
Grundierungen haben keinen Einfluss auf den GC-Gehalt Ihres Produkts. Wenn Ihnen der GC-Inhalt Ihrer Primer nicht gefällt, verschieben Sie sie an einen zugänglicheren Ort.
Früher führte jeder eine Behandlung der verdauten DNA mit alkalischer Phosphatase (APs) durch, um eine Selbstligation zu verhindern. In der Praxis sind APs sehr schwer zu entfernen oder zu inaktivieren und neigen dazu, das notwendige Phosphat aus Ihrem Einsatz zu entfernen, wenn Sie die Produkte bei der Ligation miteinander mischen. Dies führt zu einer Hemmung der Ligatur und verringert Ihre Erfolgschancen.
MikeyC
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