Ich untersuche ein Kernprotein und möchte eine Liste möglicher Proteine erstellen, mit denen es interagiert. Aus der Kernfraktion von 293T-Zellen führte ich eine IP (Immunpräzipitation) durch, um mein Protein herauszuziehen, und reichte alles, was ich herauszog, für eine Massenspektrometrie-Analyse ein. Ich habe auch eine IP mit einem unspezifischen Antikörper als Kontrolle durchgeführt. Ich habe eine riesige Liste von Treffern und bin mir nicht sicher, wie ich sie priorisieren soll. Ich kann die Treffer, die auch mit dem unspezifischen Antikörper heruntergekommen sind, manuell entfernen, das sind offensichtlich nur klebrige Proteine. Ich habe mich in Pubmed nach Möglichkeiten umgesehen, um nicht-quantitative Massenspezifikationstreffer zu priorisieren, aber ich bin mir nicht sicher, ob eine davon in meinem Fall funktionieren würde. Alle von ihnen erfordern mehrere Massenspezifikationswiederholungen - ich kann das tun, wenn ich muss, aber ich hätte gerne eine Möglichkeit, meine anfänglichen Daten intelligenter zu betrachten.
Wenn sie verfügbar sind, sprechen Sie mit den Personen, die Ihre Daten analysiert haben. Ihr Wissen zu nutzen ist intelligent.
Ich gehe davon aus, dass zwei kritische Schritte abgeschlossen sind. Erstens, dass Ihre Ergebnisse korrekt durchsucht wurden. Ich gehe auch davon aus, dass die Peptid- und Proteinidentifikationen gefiltert wurden, um eine falsche Entdeckungsrate von 1:100 auf jeder Ebene bereitzustellen.
Sie können alle Proteine entfernen, die in Ihrer Affinitätsreinigungskontrolle identifiziert wurden. Eine weitere Option ist die Verwendung des Contaminant Repository for Affinity Purification (CRAPome) , das einen formalen Rahmen für die Entfernung von kontaminierenden Proteinen bietet. Es ist eine nette Ressource, wenn Ihre Daten kompatibel sind.
Mit den restlichen Proteinen muss man arbeiten, das ist das
Liste potenzieller Proteine, mit denen [Ihr Protein] interagiert.
Priorisieren Sie diese Proteine basierend auf der Biologie Ihres experimentellen Systems. Wenn die Liste klein ist, arbeiten Sie die Funktion jedes Proteins durch und beurteilen Sie, wie es zu der Biologie passt, die Sie erforschen.
Um die potenziellen funktionellen Verbindungen zwischen den Proteinen zu bewerten, können Sie ein In-Silico- Netzwerk erstellen . Markov-Clustering kann das Vorhandensein funktionell unterschiedlicher Proteingruppen innerhalb eines Netzwerks hervorheben. Der oben verlinkte String kann dies tun. Zentralitätsmaße können das Vorhandensein von Proteinen mit dem Potenzial anzeigen, das Verhalten des Netzwerks zu beeinflussen.
Bei größeren Listen können Sie auch die Funktion der Proteine in der Liste bewerten, indem Sie eine funktionelle Annotationsanreicherungsanalyse durchführen. Es gibt viele andere Dinge, die Sie tun könnten, aber das Hauptziel ist, die Biologie an der Spitze Ihrer Bemühungen zu halten.
Abschließend erwähnen Sie, dass Wiederholungen notwendig sind. Die Analyse der Daten ist zeitaufwändig. Wenn es sich um einen Testlauf handelte, vergewissern Sie sich, dass der Test erfolgreich war, und führen Sie dann die Replikate aus. Die Zeit, die mit der Analyse unvollständiger Daten verbracht wird, kann damit verbracht werden, den Datensatz zu vervollständigen oder sicherzustellen, dass die richtigen Daten gesammelt werden. Quantitative Daten können sehr nützlich sein, und mit Vorsicht können Shotgun-Proteomik-Ansätze quantitative Daten liefern, aber die Leute, die die Maschine bedienen, müssen konsultiert werden, wenn quantitative Daten erforderlich sind.
Sie können nach den am häufigsten vorkommenden Proteinen in Ihrer Probe suchen. Obwohl, wie Sie sagen, die LC-MS-Analyse Ihres IP nicht quantitativ war, können Sie dennoch versuchen, eine quantitative Schätzung zu erhalten. Zur Erläuterung können Sie beispielsweise die Sequenzabdeckung Nr. verwenden. von PSMs für jedes Protein, nein. von Peptiden, die für ein Protein identifiziert wurden, Anteil der Spektrums-ID usw. als Proxys für die Häufigkeit.
Es besteht eine grobe Korrelation zwischen der Häufigkeit eines Proteins und all diesen Mengen. Wenn ein Protein häufiger vorkommt, ist es wahrscheinlicher, dass Sie eine größere Anzahl von Peptiden davon identifiziert haben, mehr nein. der ihm zugewiesenen PSMs hätte es eine höhere Sequenzabdeckung usw. Unterschiedliche Personen verwenden unterschiedliche Dinge. Ich habe oft nein verwendet. von PSMs, normalisiert durch die Länge des Proteins, als Schätzung für die Häufigkeit dieses Proteins.
Diskutieren Sie, wie bereits erwähnt, mit den Personen, die Ihre Daten analysiert haben. Als Faustregel würde ich meine Daten zuerst auf 1 % FDR auf PSM-Ebene, dann auf Peptidebene und dann auf Proteinebene filtern. Dann würde ich alle Proteine wegwerfen, die nicht durch mindestens zwei einzigartige Peptide identifiziert wurden. Dann würde ich die in der Negativkontrollliste identifizierten Proteine vergleichen und die gemeinsamen IDs entfernen. Sortieren Sie dann die verbleibende Liste nach Nr. von PSM für jedes Protein. Dies würde eine Schätzung der häufiger vorkommenden Proteine in der IP-Probe ergeben. Um ein Beispiel zu nennen, sollte Ihr Köderprotein (Protein, gegen das Sie den IP durchgeführt haben) das am häufigsten vorkommende Protein in Ihrer Probe sein. Proteine danach könnten dann als Interaktionspartner Ihres Köders angesehen werden.
Denken Sie daran, dass dies keine geeignete quantitative Methode zur Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Affinitätsreinigung in Verbindung mit LC-MS ist. Aber es ist ein nützlicher Anfang. Ich habe immer vorläufige Informationen aus einer solchen Analyse verwendet, um bessere zu entwerfen. Lesen Sie auch über gegenseitige IPs, um Interaktionen zu bestätigen.
Michael_A
Charlie Parker