Ich bin ein Ingenieurstudent und studiere, wie elektrische Felder Zellen beeinflussen, insbesondere das Phänomen der Elektroporation in lebenden Zellen.
Ich weiß, dass die Elektroporation weit verbreitet ist, um Gene in Zellen einzuführen, aber die Durchführung eines vollständigen Transfektionsexperiments ist in dem Labor, in dem ich arbeite, nicht so machbar.
Meine Frage ist:
Wenn ich das Prinzip der Elektroporation demonstrieren möchte, also dass sich Zellen öffnen und Substanzen aus der Umgebung aufnehmen, indem ich eine Art Farbstoff verwende, den ich später visualisieren kann, was könnte ein gutes Modell für diese Art von Experiment sein? Konkret - welcher Farbstoff, welche Zellen könnten dafür verwendet werden?
Mit der folgenden Methode erhalten Sie viele falsch positive Ergebnisse, und eine echte Transfektion eines fluoreszierenden Proteins ist immer der richtige Weg, denn dann beweisen Sie, dass die Transfektion wirklich erfolgreich war.
Sie könnten jedoch versuchen, DAPI zu verwenden , gefolgt von Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie. DAPI ist ein sehr heller Farbstoff für DNA und kann eine intakte Zellmembran nicht passieren. Wenn die Zellmembran zerstört wird, zB durch Nekrose, dringt DAPI in die Zelle ein. Ich habe noch nie jemanden gesehen, der versucht hat, die Elektroporation auf diese Weise zu beweisen, aber es wird einen Versuch wert sein. Es könnte sein, dass die Zeit für DAPI zu kurz ist, um in die Zelle einzudringen, also müssten Sie Ihr Setup optimieren.
Ich würde Folgendes versuchen: Bereiten Sie eine Zelllösung mit DAPI vor (so etwas wie eine Konzentration von 5 µM sollte ausreichen). Teilen Sie die Lösung in zwei Elektroporationsküvetten auf, führen Sie die Elektroporation mit einer Küvette durch, lassen Sie die zweite als Kontrolle unberührt. Analysieren Sie die Proben nach der Elektroporation MOMENTARIY (bedeutet: innerhalb weniger Minuten) mit einem Durchflusszytometer (wenn möglich).
Was die Zellen betrifft, können Sie alles verwenden. Ich schlage eukaryotische Zellen vor, weil sie einfacher zu visualisieren sind als Bakterien. Für die aseptische Handhabung von Zellen benötigen Sie jedoch eine Laminarströmungshaube. Theoretisch könnten Sie auch Bakterien verwenden, die einfacher zu handhaben sind, aber ich habe keine Erfahrung mit Immunfluoreszenz bei Bakterien.
bobthejoe
Armatus