Frage: Speziell zu Ampicillin; Wann sollte ich beim Züchten von Zellen in TB (terrific bouillon) zur Proteinexpression erwarten, dass das Ampicillin aufgrund des Abbaus durch b-Lactamasen verschwunden ist? (und wie viel Ampicillin wird zusätzlich zu den standardmäßigen 100 ug/ml hinzugefügt)
Hintergrund : Ich habe Gerüchte gehört, dass das gesamte Ampicillin (100 ug/ml) innerhalb weniger Stunden (2-3) abgebaut wird, aufgrund der enormen Menge an b-Lactamasen, die von den Bakterien abgesondert werden. Ich habe auch gehört, dass einige darüber keine Bedenken haben , weil 2-3 Stunden sowieso ausreichen, damit die Kultur alles andere, was wächst, nachdem das Ampicillin weg ist, übertrifft. Andererseits schreiben einige Leute auch, dass sie alle 2-3 Stunden mehr Ampicillin hinzufügen, um die Selektivität aufrechtzuerhalten; Ich sehe jedoch keinen Sinn darin, die Selektivität aufrechtzuerhalten, solange ich viel Protein habe. Ich werde die Zellen sowieso lysieren und sie für nichts anderes verwenden.
Meine Wachstumsbedingungen: Wachsen bei 37 Grad bis OD600 = 1 (dauert etwa 3 Stunden), dann mit IPTG induzieren und bei 25 Grad für 18 Stunden wachsen, 200 U / min die ganze Zeit.
Endkommentar : Ich weiß, dass man im Allgemeinen auf das teurere Carbenicillin umsteigen kann, das langsamer abgebaut wird, aber mich interessiert mehr, „wie schlecht“ Ampicillin für mein Allgemeinwissen wirklich ist (und ich werde es sowieso weiter verwenden). Außerdem: Alle allgemeinen Gedanken oder Verweise auf Literatur zu diesem Thema, speziell für Ampicillin, sind willkommen.
ziemlich interessante Frage. Der Selektionsdruck ist für jede Art von Arbeit sehr wichtig. Und es ist wahr, Amplicilin wird in den Medien aufgrund der Sekretion von Beta-Lactumase abgebaut. Dies ist eine Einschränkung, der wir uns stellen müssen, obwohl es Möglichkeiten gibt, dies zu umgehen.
Zum Beispiel werden Sie beim Klonen auf einem Teller manchmal "kleinere" Kolonien bemerken, die um eine zentrale große herumwachsen. Dies ist auf Beta-Lactumasen zurückzuführen. Sie sind kein Problem, wenn Sie die zentrale Kolonie nehmen und sie in frisches Medium mit neuem Amplicilin legen. Sie werden einfach aussterben. Keinen Schaden angerichtet.
In flüssiger Kultur ist es gut, die Kultur nicht zu "übersättigen". Lassen Sie es in der Regel nicht über OD600 = 1 kommen. Verwenden Sie außerdem keine Altbestände, da dies Probleme bei der Auswahl verursacht und verwenden Sie höhere Konzentrationen von Ampicillin, wenn Sie immer noch Probleme bei der Auswahl haben!
Im Allgemeinen sind 100 ug/ml für die meisten Selektionen beim Klonen Standard und sollten für das, was Sie tun, ausreichen. Es scheint, dass Ihr Protokoll für die Proteinisolierung gut funktionieren sollte.
Letzte Bemerkungen – es ist ein Problem, an das die meisten Mikrobiologen nicht denken. Ampicillin hat seine Grenzen!
https://www.addgene.org/mol-bio-reference/antibiotics/
https://bitesizebio.com/10188/was-das-problem-mit-ampicillin-auswahl/
Neugieriger Baum
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