Verlängerung eines kleinen DNA-Fragments

Gibt es eine Möglichkeit, ein kleines DNA-Fragment, sagen wir 150 bp, zu verlängern, indem Kopien von sich selbst erstellt und jede Kopie dieses kleinen Fragments an das Ende dieser 150 bp-Sequenz angehängt wird?

Zum Beispiel möchte ich ein 1 kbp + DNA-Fragment, das aus Kopien dieser exakten 150 bp-Sequenz besteht.

Ich führe optische Tests an DNA-Strängen durch, aber das Problem ist, dass die DNA-Fragmente, auf die ich abziele, zu klein sind.

Wenn das DNA-Fragment jedoch nur eine wiederholte Sequenz des DNA-Fragments ist, das ich teste, werden die Tests dieselben Ergebnisse liefern. Aus diesem Grund versuche ich, einen langen DNA-Strang aus nur einem DNA-Fragment zu erstellen, das immer wieder kopiert wird.

Gibt es ein Verfahren, dem ich folgen kann, um dies zu erreichen?

Nun, Sie können PCR in Verbindung mit einer Ligationstechnik verwenden ...
Was genau versuchst du zu tun? Wenn Sie Ihren Versuchsaufbau und Ihre Ziele klarer erläutern, können wir Ihnen möglicherweise weiterhelfen. So ist diese Frage eher vage.
@MattDMo Hallo, im Grunde führe ich optische Tests an DNA-Strängen durch, aber das Problem ist, dass die DNA-Fragmente, auf die ich abziele, zu klein sind. Wenn das DNA-Fragment jedoch nur eine wiederholte Sequenz des DNA-Fragments ist, das ich teste, werden die Tests dieselben Ergebnisse liefern. Aus diesem Grund versuche ich, einen langen DNA-Strang aus nur einem DNA-Fragment zu erstellen, das immer wieder kopiert wird.
Wenn beide Enden die Bedingung erfüllen, unter der Ligase funktioniert, behandeln Sie einfach mit Ligase. Aber Sie erhalten Ligationsprodukte unterschiedlicher Länge. Sie können nach der Elektrophorese aus Agarose schneiden, wenn Sie der Meinung sind, dass die Ausbeute ausreicht.
Könnten Sie weitere Details angeben? Hat Ihr Fragment stumpfe Enden? Ist das gesamte Fragment wichtig oder könnten Sie bei Bedarf ein wenig kürzen?

Antworten (3)

Wenn Sie versuchen, 1 kbp sich wiederholender 150-bp-Sequenzen zu erhalten, ist die Synthese als großer Block möglicherweise die bessere Idee. Es kostet ca. 150-300 $, spart aber potenziell jede Menge Zeit. (siehe gBlock von IDT in den USA)

PCR und Ligation mit repetitiven Sequenzen ist eine Qual. Es mag stimmen, dass Sie Geld sparen, aber Zeit und Frust könnten teurer sein.

IDT mag keine sich stark wiederholenden Sequenzen, es wird schwierig, eine Qualitätskontrolle durchzuführen. Es hängt jedoch von Ihrer genauen Sequenz ab, also setzen Sie Ihre Sequenz in ihre Form und sehen Sie, ob sie mit einem Problem zurückkommt. Wenn nicht, ist dies wahrscheinlich eine gute und kostengünstige Möglichkeit, dies zu tun. Stellen Sie sicher, dass Sie auch PCR-Primer für Ihre Sequenz erhalten, damit Sie mehr herstellen können.

Angesichts der Kosten oder der DNA-Synthese könnten Sie wahrscheinlich die beiden Einzelstränge bestellen und aneinander binden. Konstruieren Sie zwei komplementäre Restriktionsenzym-überhängende Enden an der Sequenz. Zum Beispiel manipuliert an einem Ende eine partielle BamHI- Stelle und am anderen Ende eine BglII- Stelle. Diese klebrigen Enden glühen, aber das resultierende Ligationsprodukt kann von keinem der Enzyme geschnitten werden.

Durch abwechselnde Ligations-, Verdauungs- und Ligationszyklen können Sie Konkatemere Ihres Ausgangsfragments aufbauen. Dann können Sie die längeren Stücke gelreinigen und sie in einen geeignet präparierten Vektor subklonieren.

Setzen Sie stattdessen Adapter ein? (wenn Orientierung kein Problem ist)
Wenn die Orientierung kein Problem ist, können Sie während der PCR ein Blunt-Enzym oder eine Blunt-End-Polymerase (wie Phusion-Polymerase) verwenden und dann eine Blunt-End-Ligation durchführen. NB-Primer müssen phosphoryliert werden!

Ich schlage vor, Sie versuchen es mit Recursive Directional Ligation . Es soll genau das tun, was Sie anstreben, nämlich kurze DNAs zu längeren "polymerisieren". Das Protokoll finden Sie hier http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bm015630n

Verlängerung eines kleinen DNA-Fragments
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