Proteinpuffer wie PBST, das beim Western Blot verwendet wird, werden normalerweise auf pH 7,4 eingestellt. Wenn ich versuche herauszufinden, warum, finde ich einige Informationen über den optimalen pKa-Wert für die Proteinstabilität. Ich bin mir nicht sicher, ob ich das wirklich verstehe, denn es scheint unabhängig vom Protein durchgängig zu sein - die meisten Labors verwenden nur PBST mit einem pH-Wert von 7,4.
Ich interessiere mich ein bisschen dafür und habe ein paar Fragen
Der richtige pH-Wert hängt von den Eigenschaften der Proteine ab, die Sie nutzen möchten. Dies ist ein großer Unterschied zwischen der Extraktion von Proteinen aus Gewebe und der Durchführung von Western Blots.
Proteine zu extrahieren bedeutet, sie in wässriger Lösung löslich zu halten. Arbeiten am pI des Proteins könnte die schlechteste Wahl sein, da das Protein dann keine Nettoladung aufweist, was typischerweise seine Wasserlöslichkeit verringert. Ein Extremfall wären die hochbasischen Histonproteine mit sehr hohen pI-Werten, die jedoch am besten bei niedrigem pH-Wert extrahiert werden.
Nachdem Proteine auf einem denaturierenden Gel laufen gelassen und für Western-Blotting auf eine Membran übertragen wurden, sind sie bereits denaturiert und durch hydrophobe Wechselwirkungen, die vom pH-Wert kaum beeinflusst werden, außer vielleicht in Extremen, stark an die Membran gebunden. Für das Blotting will man die Wechselwirkung von Epitopen auf dem Protein mit den Antikörpern dagegen ausnutzen. Während der Antikörperproduktion finden die Wechselwirkungen zwischen den Epitopen und den Antikörper-spezifischen Rezeptoren auf den Antikörper-produzierenden Zellen bei einem normalen pH-Wert des extrazellulären Körpers von 7,4 statt. Die Verwendung dieses pH-Werts für das Blotting rekapituliert am besten den Ladungszustand sowohl der Epitope als auch der Antikörper, wie sie existierten, als Zellen selektiert wurden, die die besten Antikörper produzierten.
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