Warum funktioniert meine Anti-Ubiquitin-Antikörper-Visualisierung nicht auf meinem PAGE-Gel?

Ich verwende 2D-Gelelektrophorese, um polyubiquitinierte Proteine ​​sichtbar zu machen. Obwohl ich Aktin und Hitzeschockprotein mit geeigneten Antikörpern sehen kann, kann ich sie nicht mit Anti-Ubiquitin-Antikörpern visualisieren. Könnte es ein Abbauproblem sein?

Ich lasse die isoelektrische Fokussierung über Nacht (mindestens 18 Stunden) bei 200 V und die letzten 30 Minuten bei 700 V laufen. Ich mache mir Sorgen, dass ich mehr Volt als nötig anlege, da das Standardprotokoll 200 V für 20 Minuten, 450 V für 15 Minuten, 750 V für 15 Minuten, 2000 V für 30 Minuten ist, aber aufgrund von Problemen mit dem Netzteil I kann dies nicht.

Ich bin mir sicher, dass ich Polyubiquitinierung habe, weil ich ein Medikament verwende, das die Akkumulation von polyubiquitiniertem Protein in den Zellen auslöst.

Ich möchte auch hinzufügen, dass die Zellen durch Schaben in kaltem PBS gesammelt und dann in Eis gelegt werden und das Pellet auch bei 4 Grad gesammelt wird, um einen Proteinabbau zu verhindern.

Haben Sie Protease-Inhibitoren in Ihrem Lysepuffer? Wenn ja, welche? Funktioniert Ihr Anti-Ubiquitin-Antikörper auch bei einem direkten SDS-PAGE-Western-Blot?
MattDMo, Mein Anti-Ubiquitin-Antikörper funktioniert beim Western Blot.
MattDMo, mein Anti-Ubiquitin-Antikörper funktioniert beim Western Blot, aber ich verwende keinen Lysepuffer. Nachdem ich meine Zellen durch Schaben mit PBS gesammelt habe, zentrifugiere ich das Eppendorf und friere das trockene Pellet (ohne PBS) in flüssigem Stickstoff ein, dann resuspendiere ich das Pellet direkt in Rehydratisierungspuffer (Harnstoff, CHAPS, Ampholyte, Bromphenolblau, DTT) und ich füge Harnstoff hinzu und wirbele, bis ich sehe, dass sich am Boden ein wenig Harnstoff ausfällt, dann zentrifugiere ich es bei 10.000 U / min 5 min und verwende direkt den Überstand um meine Streifen zu rehydrieren.
Haben Sie eine positive Kontrolle, die Sie neben Ihren Proben verwenden könnten?
Das ist es, wonach ich suche, ich versuche zu zeigen, dass es möglich ist, Polyubiquitinierung von negativer Kontrolle zu unterscheiden, aber ich habe dies noch nie zuvor getan, also habe ich nichts, was ich mit einer positiven Kontrolle vergleichen könnte, wenn ja, das wäre es bedeutet, dass das Verfahren endlich funktioniert und die Flecken erscheinen.
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Antworten (1)

Es gibt stabile ubiquitinierte Proteine ​​in Säugerzelllysaten, selbst wenn aktive Proteosomen in Zellen existieren.

Zunächst sollten Sie sicherstellen, dass der Antikörper für WB geeignet ist.

Dann würden Sie fragen, ob Ihr WB-System, das den Antikörper verwendet, funktioniert. Sie können den Zustand optimieren, indem Sie nur 1D SDS-PAGE gefolgt von WB verwenden.

Für die Bedingung der isoelektrischen Fokussierung erhalten Sie nach Abschluss der Fokussierung einen sehr hohen elektrischen Widerstand. Daher sollten Sie den Strom überwachen, nachdem Sie die Spannung auf 700 V geändert haben. Der Strom nimmt allmählich ab und stabilisiert sich auf einem bestimmten Niveau. Aber ich weiß nicht, dass Sie eine Stabilisierung um 700 V sehen können.

Sie sollten auch überprüfen, ob wichtige Proteine ​​wie Aktin am erwarteten pI gut Flecken bilden. Das könnte sagen, ob das Forcieren ungefähr abgeschlossen ist.

Ja, der Antikörper ist für WB geeignet, da ich ihn zuvor verwendet habe. Ich verwende eine Art hausgemachte Schaltung, die mein System mit Elektroden verbindet, die mit einem Wasserbehälter verbunden sind, sodass der Strom meiner Meinung nach in Ordnung ist. Das Proteosom wird durch das Medikament, das ich verwende, verändert, sodass sich die Proteine ​​in den Zellen ansammeln. Wenn ich also mehr Zeit in das Protokoll stecke, könnte es ein Problem sein, weil polyubiquitiniertes Protein empfindlicher für Zerstörung sein könnte, oder aus irgendeinem Grund?
Harnstoff hat starke denaturierende Wirkungen, sodass Sie keine Proteaseaktivitäten im Rehydratisierungspuffer haben würden. Ich bin mir über die Proteasomaktivitäten während des Gefriertrocknungsprozesses nicht sicher. Vielleicht ok, aber keine Garantie. Können Sie den Rehydrationspuffer direkt zu den Zellpellets hinzufügen? Oder Sie können Aceton oder 10 % TCA hinzufügen, um Proteine ​​auszufällen, sodass Proteasen sofort denaturiert und inaktiviert werden und Proteine, an denen Sie interessiert sind, vor Abbau geschützt werden können.
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