Vortexen des Antikörpers vor dem Färben vergessen

Pfui. Habe letztes Wochenende ein Immunfluoreszenz-Experiment durchgeführt und vergessen, sowohl meine primäre als auch meine sekundäre Antikörperlösung zu verwirbeln.

Und mein Endergebnis sieht dunkler aus, als es sein sollte. Ist es möglich, dass das Vortexen nicht dazu beigetragen hat?

Ich denke, die Frage ist, ist das Vortexen wirklich notwendig? Es würde auf die Strömungsdynamik hinauslaufen. Wie lange dauert es, bis ein Tropfen Antikörper in einem 1000-µL-Eppendorf-Röhrchen das Gleichgewicht erreicht? Sind es wirklich mehr als nur ein paar Sekunden? Ist das Vortexen wirklich notwendig?

Antworten (1)

Dies hängt davon ab, wie viel Zeit zwischen der Zugabe der konzentrierten Antikörper zur Verdünnungslösung und der Zugabe der verdünnten Antikörper zum Objektträger verstrichen ist. Wenn es nur ein paar Sekunden waren, dann kann ich absolut sehen, dass es einen Unterschied gibt. Selbst wenn es länger dauerte – sagen wir sogar 30–90 Sekunden – könnten möglicherweise Antikörpergradienten in der Lösung ohne Vortexen vorhanden sein. Dafür gibt es einige Gründe. Erstens, viele unkonjugierte Primärantikörper, die nicht gerade bestimmt sindfür die Immunfärbung werden in einer Glycerinlösung bereitgestellt, mit Konzentrationen von etwa 10 % bis zu 50 % oder mehr, manchmal zusätzlich zu einem Trägerprotein wie BSA (ich habe früher für eine bekannte Antikörperfirma gearbeitet, und ihre sind in 50 % Glycerin mit 10 µg - 2 mg BSA pro ml, je nach Antikörpertyp). Das Glycerin verhindert, dass die Lösung bei -20 °C fest gefriert, verhindert die Bildung von Eiskristallen, schützt das Antikörperprotein vor Abbau und ermöglicht längere Lagerzeiten ohne Aktivitätsverlust. Infolgedessen dauert es jedoch länger, bis sich die Lösung in PBS oder dem von Ihnen verwendeten Verdünnungsmittel ohne zusätzliche mechanische Aktivität solubilisiert.

Andererseits kann die gleichmäßige Diffusion der Proteine ​​in alle Teile des Röhrchens einige Zeit dauern, selbst wenn der primäre (oder sekundäre) Antikörper einfach in PBS formuliert wird. Geben Sie als Experiment 1 ml PBS in ein Eppendorf-Röhrchen und fügen Sie dann etwa 10-50 µl eines dunklen Farbstoffs wie Methylenblau, Bromphenolblau oder Trypanblau hinzu. Beobachten Sie, wie es sich im Laufe der Zeit vor einem durchgehend weißen Hintergrund wie ein Stück Papier in die Lösung auflöst. Obwohl keines davon genau das gleiche Löslichkeitsprofil wie Antikörper hat, ist es gut genug, um Ihnen zu zeigen, was in den ersten 30 Sekunden oder so passiert, bis Sie den Farbstoff nicht mehr unterscheiden können.

Vortexen Sie also immer ein paar Sekunden lang, auch wenn es bei einer relativ langsamen Geschwindigkeit ist, um sicherzustellen, dass alles gleichmäßig verteilt ist.

Ich nehme an, dass ein kleiner Molekülfarbstoff wahrscheinlich schneller diffundieren wird als ein großer Antikörper. Wenn also ein Farbstoff Zeit braucht, um das gesamte Volumen zu füllen, braucht ein Antikörper wahrscheinlich mehr Zeit.
@ user137 das ist genau mein Punkt.
Mir wurde beigebracht, Proteine ​​nie zu verwirbeln, wenn ich etwas Nützliches tun wollte, aber das gleichmäßige Mischen (durch Pipettieren oder Inversion oder verlängerte Nutation oder was auch immer) einer Lösung ist so ziemlich erforderlich, damit wir etwas Sinnvolles über eine biochemische Reaktion sagen können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die @MattDMO-Antwort richtig ist und lokale Unterschiede in den methodischen Gepflogenheiten berücksichtigt.
@MaximilianPress wurde dir falsch beigebracht. Das einzige Protein, das ich nicht vortexe, ist DNase I, das zum Verdauen von DNA auf einer RNA-Prep-Spin-Säule verwendet wird - und nur, weil die Anweisungen sagen , es nicht zu vortexen. Proteine ​​sind im Allgemeinen sehr strukturstabil, und eine schwache Kraft wie das Vortexen wird ihnen kein bisschen schaden, das verspreche ich. Ich arbeite seit fast 20 Jahren mit Proteinen und habe noch nie einen Biochemiker getroffen, der gesagt hätte, dass Proteine ​​im Allgemeinen oder Antikörper im Besonderen nicht gevortext werden sollten. Wenn Sie jetzt zum Beispiel native Konformations-Co-IPs machen, können Sie natürlich etwas mehr sein (...)
(...) heikler als bei der Arbeit mit einem Antikörper für Western Blot oder Immunfluoreszenz, aber auch dort ist die Gefahr mehr Hitze als körperliche Gewalt. Antikörper sind unglaublich zäh und widerstandsfähig, können oft in einer Vielzahl von chemischen Umgebungen eingesetzt werden und müssen im Allgemeinen nur dann speziell behandelt werden, wenn sie an lichtempfindliche Fluorochrome konjugiert sind. Ja, Sie möchten nicht unbedingt, dass sich Blasen in Ihrer Lösung bilden, aber das gilt wiederum nur, wenn Sie in einem konformationsempfindlichen Assay arbeiten.
Danke für deine Antwort. Ich nehme an, dass sie kein Glycerin enthalten, da sie bei -4 Grad aufbewahrt werden. Trotzdem gut zu überlegen. Das Färbeexperiment werde ich auf jeden Fall ausprobieren. In diesem Sinne, wie lange dauert es, wenn überhaupt, bis Antikörper bei -4 Grad „verderben“? Könnte das dazu beigetragen haben?
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@ amd1972 als Antwort auf Ihre Frage - es kommt darauf an. Wenn der Antikörper Natriumazid enthält, sollte er nicht kontaminiert werden, insbesondere wenn Sie gefilterte Pipettenspitzen verwenden (ich verwende keine normalen Spitzen mehr). Sie können sich beim Anbieter erkundigen, ob Stabilitätsstudien durchgeführt wurden oder ob die Charge, die Sie haben, ein Verfallsdatum hat. Solange Sie vorsichtig damit umgehen, sollte es mindestens ein paar Jahre halten - einige können viel länger halten, andere nicht so sehr. Wenn Sie möchten, können Sie 50 % Glycerin hinzufügen und es bei -20 lagern, denken Sie daran, es zu beschriften und den Verdünnungsfaktor zu ändern.
Super, danke. Eine letzte Frage. Ich habe dazu einen weiteren Thread erstellt: Was ist mit dem Eiskühlungsschritt nach der Antigengewinnung, der in den meisten Immunfluoreszenzprotokollen enthalten ist? Diesen Schritt habe ich auch vergessen. Ich war in der Schule und es ist lange her, seit ich diese Experimente gemacht habe, also bin ich, wie Sie sehen können, eingerostet.
@ amd1972 bin mir da nicht sicher - ich färbe normalerweise Zellen, nicht Gewebe, und ich bin auf meinem IHC ein wenig eingerostet.
Vortexen des Antikörpers vor dem Färben vergessen
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