In Protokollen für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) sehe ich oft Anweisungen, die Gellösung zu entgasen, indem sie 10-15 Minuten lang unter Vakuum gesetzt wird, bevor das Gel polymerisiert wird.
Normalerweise mache ich das nicht, und als ich es einmal ausprobiert habe, konnte ich keinen Unterschied feststellen. Daher frage ich mich, was genau die Entgasung bewirken soll und wie groß der Effekt sein soll.
Jegliche Literatur, die die Wirkung der Entgasung untersucht, wäre willkommen.
Der Grund für die Entgasung Ihrer Gele ist die Entfernung von Sauerstoff. Sauerstoff im Gel stört die Polymerisation, verlangsamt sie und macht sie weniger konsistent, sodass die Entgasung sie schneller und gleichmäßiger macht.
Aus dem EncorBio SDS-PAGE-Protokoll :
Die Polymerisation verläuft schneller und gleichmäßiger, wenn Sie die ersten drei Lösungen vor der Zugabe der letzten drei Reagenzien einige Minuten in einem Ehrlenmeyer-Kolben am Hausvakuum entgasen. Molekularer Sauerstoff hemmt die Polymerisation durch Reaktion mit den freien radikalischen SO 4 – -Ionen, was eigentlich der Grund ist, warum PAGE-Gele in Röhrchen oder zwischen Platten gegossen werden und nicht in oben offene horizontale Apparaturen, wie dies bei Agarose der Fall ist. Es ist auch eine gute Idee, etwas Isopropanol auf das Gel zu schichten, da dies verhindert, dass Sauerstoff eindringt und die Polymerisation hemmt.
Sauerstoff kann auch zur Oxidation von Proteinprodukten führen, was entscheidend sein kann, wenn Sie die Produkte dann extrahieren und für etwas anderes verwenden möchten (z. B. Sun & Anderson, 2004 ).
Schließlich können Blasen in Ihrem Gel die Ergebnisse verzerren und sie weniger reproduzierbar machen, da sich die Blasen nicht bei jeder Wiederholung gleichmäßig bilden und das physikalische Medium des Polyacrylamids stören. Ein weiterer Zweck der Entgasung besteht also darin, die Wiederholbarkeit sicherzustellen.
Das Infoblatt zur Acrylamid-Polymerisation von Bio-Rad enthält die besten Informationen, die ich finden konnte:
Die Bildung von Polyacrylamidgelen erfolgt über radikalische Polymerisation. Die Reaktion wird daher durch jedes Element oder jede Verbindung gehemmt, die als Radikalfänger dient (Chrambach 1985). Sauerstoff ist ein solcher Inhibitor. Sauerstoff, der in der Luft vorhanden, in Gellösungen gelöst oder an den Oberflächen von Kunststoff, Gummi usw. adsorbiert ist, hemmt und verhindert in extremen Fällen die Acrylamidpolymerisation. Die richtige Entgasung ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit. Daher ist einer der wichtigsten Schritte bei der Herstellung von Polyacrylamidgelen das Evakuieren oder „Entgasen“ von Gellösungen unmittelbar vor dem Ausgießen des Gels. Dazu wird der Kolben mit der Gellösung in eine Vakuumkammer oder unter einen starken Sauger gestellt. In einigen Fällen kann eine Vakuumpumpe erforderlich sein.
Pufferstammlösungen und Monomerstammlösungen werden üblicherweise bei 4°C gelagert. Kalte Lösungen haben eine größere Kapazität für gelösten Sauerstoff. Der Entgasungsprozess ist schneller und vollständiger, wenn die Gellösung auf Raumtemperatur (23–25 °C) gebracht wird, bevor die Entgasung beginnt. Wenn außerdem eine kalte Gellösung unter Vakuum gesetzt wird, neigt der Evakuierungsprozess dazu, die Lösung kalt zu halten. Das Gießen eines Gels mit einer kalten Lösung hat eine erhebliche negative Auswirkung auf die Polymerisationsgeschwindigkeit und auf die Qualität des resultierenden Gels.
Eine Polymerisation, bei der Riboflavin als einer der Initiatoren verwendet wird, erfordert eine Entgasung. Die Umwandlung von Riboflavin von der Flavo- in die Leuco-Form (die bei der Initiation aktive Spezies) erfordert tatsächlich eine kleine Menge Sauerstoff (Gordon 1973).
Dies erklärt, warum die hauptsächlich durch Riboflavin initiierte Polymerisation durch vollständiges Entgasen vollständig blockiert werden kann. Sauerstoff im Überschuss zu dem, der zur Umwandlung von Riboflavin in die aktive Form benötigt wird, hemmt jedoch die Verlängerung der Polymerkette, wie dies bei Reaktionen der Fall ist, die nur durch Ammoniumpersulfat und TEMED initiiert werden. Obwohl die Entgasung immer noch wichtig ist, um die Hemmung zu begrenzen, darf sie also nicht so umfangreich sein, dass sie die Umwandlung von Riboflavin in die aktive Form verhindert. Bei durch Riboflavin/TEMED- oder Riboflavin/TEMED/Ammoniumpersulfat-Systemen initiierter Polymerisation sollte die Entgasung 5 min nicht überschreiten.
Eine Folge der Wechselwirkung von Riboflavin mit Sauerstoff ist, dass Riboflavin als Sauerstofffänger zu wirken scheint. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, dass die Zugabe von Riboflavin (5 µg/ml) zu Sammelgellösungen, die Ammoniumpersulfat/TEMED-Initiatoren enthalten, zu einer saubereren, gleichmäßigeren Polymerisation an Geloberflächen führt, die Sauerstoff ausgesetzt sind (z. B. Kämme). Der gleiche Effekt könnte wahrscheinlich durch eine gründlichere Entgasung von Lösungen ohne Riboflavin erreicht werden.
Unabhängig davon, ob eine chemische Polymerisation (Ammoniumpersulfat/TEMED) oder eine photochemische Polymerisation (Riboflavin/TEMED oder Riboflavin/TEMED/Ammoniumpersulfat-Initiatoren) verwendet wird, erfordern reproduzierbare Gelqualität und Trenneigenschaften eine sorgfältige Beachtung der Temperatur der Gellösung vor dem Entgasen sowie der Entgasungszeit, -temperatur, und Vakuum. Diese Parameter sollten bei jeder Herstellung von Gelen konstant gehalten werden.
Entschuldigung für die langen Zitate, aber sie werden hier eingefügt, falls die Originalquellen verschwinden.
Verweise:
Ich habe kürzlich Gele mit unterschiedlichen Acrylamid/Bisacrylamid-Verhältnissen verwendet. Die Leute arbeiten normalerweise mit Verhältnissen von 1:37,5, 1:29, die üblicherweise für DNA- und Proteingele verwendet werden. Ich habe festgestellt, dass beim Arbeiten mit niedrigeren Verhältnissen von 1:200 bis 1:500 die Entgasung grundlegend wird, um eine reproduzierbare Auflösung meiner Proteine zu gewährleisten. Wenn ich die Mischung in einem dieser Gele nicht entgase, trennen sich einige der Proteine, die ich auflöse (die sehr nahe beieinander wandern), nicht gut genug. Außerdem kann die Zeit, die zum Polymerisieren des Gels benötigt wird, zwischen 20 und etwa 45 Minuten liegen, wenn ich die Lösung nicht vorher entgase. Entgasungslösungen mit normalen Vernetzerverhältnissen von 1:29, 1:37,5 scheinen meiner Erfahrung nach keine große Wirkung zu haben, außer dass sie schnellere Polymerisationszeiten haben. Vielleicht macht es einen Unterschied bei Gelen mit geringerer Konzentration (8-5%),
Benutzer560