Langzeitlagerung von bereits gegossenen Agarose-Ethidiumbromid-Gelen

Ich hatte eine meiner Meinung nach clevere Idee: Bewahre die Agarosegele auf, die ich gieße, und schneide nur so viele Bahnen ab, wie ich später laufen muss, um die Verschwendung von Agarose (und Aufwand/Zeit) zu minimieren, wenn ich viele Elektropheresen durchführen muss mit einer kleinen Anzahl von Fahrspuren.

Ich erkannte, dass das EtBr mit der Zeit aus meinem Gel in den Puffer diffundieren würde, in dem die Gele aufbewahrt werden. Da ich 2 µl EtBr zu 50 ml Gel hinzufüge und die Gele in 400 ml TAE-Puffer aufbewahrt wurden, fügte ich 16 hinzu &mgr;l EtBr zum Puffer, mit der Begründung, dass jetzt die Konzentrationen gleich sind und keine Nettodiffusion stattfinden wird.

Nach einigen Wochen bemerkte ich jedoch, dass das EtBr-Signal des Gels stark abgeschwächt war. Was kann ich tun, um das zu beheben? Ich sehe folgende Optionen:

  • Verwenden Sie eine höhere EtBr-Konzentration im Puffer (wie viel?)
  • Puffer wöchentlich wechseln, dabei jedes Mal frisches EtBr zugeben
  • Decken Sie den transparenten Behälter mit Aluminiumfolie ab, um eine hypothetische Photobleichung zu verhindern

Welche löst mein Problem am ehesten? Soll ich einfach aufgeben und Gele wegwerfen, die älter als ein oder zwei Tage sind (ich möchte diese Option vermeiden, da Aufzeichnungen erforderlich sind, um nachzuverfolgen, wann das Gel zuletzt hergestellt wurde)?

Was ich gesehen habe, ist, eine Flasche Agarosegel aufzubewahren, es dann zum Schmelzen zu erhitzen, alles, was Sie brauchen, in einen Gelgießer zu gießen und Ihr Ethidium hinzuzufügen. Auf diese Weise wird Ihr großer Gelvorrat nicht mit Ethidium kontaminiert und Sie müssen sich keine Gedanken über den Verlust des Ethidiumsignals machen.
@ user137 Ich bewahre gegossene Gele auf, um den Aufwand zu vermeiden, jedes Mal ein Gel zu schmelzen und zu gießen, wenn ich einige Proben ausführen möchte. Die Flasche Agarose erspart mir nur das Abwiegen der Agarose, was im Vergleich dazu recht unbedeutend ist.
sahen Sie ein reduziertes Signal unter Verwendung der gleichen DNA-Konzentration oder des gleichen Konstrukts, nachdem Sie es mehrere Wochen später in einem Gel laufen ließen, das keine vorher gelaufene DNA-Bande enthielt? Ich denke, EtBr kann Fotos bleichen, also verwenden Sie einfach frischen Puffer mit frischem EtBr. Selbst mit einem EtBr auf Lager sollten Sie es um Folie wickeln! Alte Gele sind im Allgemeinen nicht gut, da sie meiner Erfahrung nach ziemlich hart und zerbrechlich werden können, daher ist es immer am besten, frische Gele zu verwenden.
@Superbest Sie könnten vorgegossene Gele ohne Ethidium lagern und dann nachfärben, aber Sie würden am Ende mehr Ethidium-Abfall haben, um den Sie sich Sorgen machen müssen.
@Bez Ja - was ich mache, ist, zuerst ein Gel mit normalem EtBr und Vertiefungen usw. herzustellen, dann das Gel in TAE-Puffer mit EtBr im Puffer zu geben, dort einige Wochen zu halten, laufen zu lassen. Ich vergleiche gleiche Mengen Leiter, und es scheint, als ob mein Signal von einem etwa zwei Wochen alten Gel vielleicht 30 % eines frischen (oder 1-2 Tage alten) Gels beträgt.
@ user137 Ja, auch eine Option. Ich möchte jedoch speziell "vorfärben" - dh EtBr auftragen, nachdem das Gel vollständig gegossen und gebrauchsfertig ist, aber bevor es tatsächlich mit DNA beladen wird. Ich frage nur, wie dies mit minimalem Signalverlust erreicht werden kann (Ihre Vorschläge sind sinnvoll - aber welche muss ich tatsächlich tun?). Wenn es unmöglich ist, wäre auch eine gute Erklärung dafür akzeptabel.
Mir wurde gesagt, dass ich ein Gel, um es haltbar zu machen, an einem kalten und dunklen Ort aufbewahren sollte, um ein nasses Handtuch gewickelt! Aber ich denke, es ist das Fotobleichen, das das Problem ist! tränken Sie es also in neuem Puffer mit frischem EtBr, nachdem Sie Ihre Proben analysiert haben. Haben Sie nicht wochenlang Schimmel in Ihrem Puffer mit Gel bekommen?
Komm schon, @Superbest, das Wiegen und Gießen von Gels dauert nur unbedeutend. Gießen Sie es ein, bevor Sie sich niederlassen, um E-Mails oder Facebook zu überprüfen: P
@Superbest siehe meine Antwort Ich musste das schon einmal durcharbeiten. Auch wenn Sie versuchen, Gele aufzubewahren, nachdem sie laufen gelassen wurden, können Sie einen Geltrockner verwenden (eines dieser Lebensmittel-Vakuumbeutel-Küchenutensilien, die Sie bei Target Work kaufen können, genauso gut wie die kommerziellen Geltrockner für 5000 US-Dollar zur Information
@WYSIWYG stimmt, das ist trivial, aber wenn Sie viele Gele wie für 400 Studenten für ein Bachelor-Lehrlabor vorbereiten, ist es viel einfacher, sie zu gießen, zu schneiden und zu lagern.

Antworten (3)

Um die Haltbarkeit zu verlängern: Nach dem Erstarren des Gels mit Laufpuffer anfeuchten. Wickeln Sie das Gel in Polyvinylchlorid ein. In Plastikbehälter mit Deckel geben. Dunkel im Kühlschrank aufbewahren. Es hält ein Jahr lang, solange Sie es bei jedem Zugriff erneut mit Puffer befeuchten. Lassen Sie es nicht in Puffer getaucht, da das etbr ausdiffundiert. das ist wahrscheinlich die Ursache deines Problems. Beachten Sie, dass bei der Bestellung vorgefertigter Gele (entweder Agarose oder Acrylamid) diese versiegelt sind und nur eine kleine Menge Puffer hinzugefügt wird, um sie hydratisiert zu halten. Darüber hinaus helfen das etbr und EDTA im Puffer, das Wachstum von Schimmelpilzen weitgehend zu verhindern, obwohl ich in etwa einem Jahr einige Male gesehen habe, wie schwarzer Schimmelpilz wächst.

Sie können den Puffer immer mit etbr aufstocken, indem Sie ihn direkt in die Elektrophoresekammer geben, bevor Sie das Gel laufen lassen (etbr muss nicht einmal im Gel sein, damit es funktioniert), obwohl ich finde, dass Sie mit dem etbr etwas empfindlicher werden im Gel. Wenn Sie es aufstocken, mischen Sie es und lassen Sie es etwa 20 Minuten lang stehen, damit das etbr diffundieren kann.

Wenn Sie versuchen, die Kosten zu senken, verwenden Sie wahrscheinlich eine höherwertige Agarose, als Sie für die Anwendung, die Sie tun, wirklich benötigen, also würde ich mir das ansehen

Wenn Sie am Ende Gele für RNA-Arbeiten aufbewahren müssen, fügen Sie Ihrem TAE-Gel unmittelbar nach der Mikrowellenbehandlung einfaches altes Clorox-Bleichmittel mit einer Endkonzentration von 1% hinzu. Es klingt verrückt, aber es funktioniert sehr gut. Sie werden RNAse vollständig hemmen und Ihre RNA-Banden werden gut aussehen !!!. Das Bleichmittel hilft auch bei der Lagerung des Gels.

OP hat bereits festgestellt, dass die Konzentrationen von EtBr innerhalb und außerhalb des Gels identisch sind.
@MarchHo Um sicher zu sein, nur weil sie identisch sind, heißt das nicht, dass es keine Netzdiffusion geben wird.
Ich kann auch die Aufbewahrung des Bleichgels bestätigen – nicht nur das, aber obwohl ich nicht darauf geachtet habe, das Bleichgel von RNAse-Kontaminanten fernzuhalten (in der gleichen Box wie normale Gele, schmutziger Elektrophoresetank), lief meine RNA und färbte sich gut .

Ich glaube, ich habe einige Beweise dafür, dass der Schlüsselfaktor Licht ist.

Seit ich diese Frage gestellt habe, habe ich den Puffer gegen frisches TAE-EtBr (gleiche Konzentration wie in meinen Gelen) ausgetauscht und meine Gele von einem gut beleuchteten Bereich in eine geschlossene, undurchsichtige Box gebracht, damit sie im Dunkeln bleiben. Nach 1 Woche ließ ich gleiche Mengen meiner Leiter im gelagerten Gel sowie ein frisches Gel laufen. Die Ergebnisse (altes Gel links, neues Gel rechts) zeigen einen sehr geringen Signalunterschied – ich schließe daraus, dass das Blockieren des Lichts ausreichend ist.

Ich bin mir nicht ganz sicher, was du tust. Lassen Sie jedes Mal das gesamte Gel laufen und schneiden Sie die Spuren ab, die Sie verwendet haben, oder legen Sie nur die gewünschten Spuren in den Tank und lassen den Rest draußen?

Im ersten Fall wird das Ethidiumbromid aus dem Gel ausgelaugt, da es positiv geladen ist, sodass jedes Mal, wenn Sie einen Strom darauf anwenden, etwas davon austritt.

Wenn letzteres der Fall ist, bin ich mir nicht sicher, warum Sie Ihr Gel überhaupt im Puffer aufbewahren. Wickeln Sie es in Frischhaltefolie ein, damit es nicht austrocknet, und bewahren Sie es fern von UV-Licht auf, um den Abbau von Ethidium zu vermeiden.

Ehrlich gesagt bin ich mir jedoch nicht sicher, warum Sie glauben, dass dies eine große Zeitersparnis sein wird? Sie können vorgeschmolzene Agarose mit hinzugefügtem Ethidiumbromid wochenlang aufbewahren, und das Gießen eines frischen Gels nimmt nicht viel Zeit in Anspruch.

Es ist letzteres. Ich habe ein großes Gel in einem Behälter aufbewahrt (leichter zu öffnen und zu schließen als Film), und ich schneide Bahnen ab, die ich brauche, und lasse nur diese Bahnen laufen.
Langzeitlagerung von bereits gegossenen Agarose-Ethidiumbromid-Gelen
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