Ich habe eine In-vitro-Transkriptionsreaktion durchgeführt und einige RNA einer einzigen Spezies und einer bestimmten Größe produziert. Ich möchte es visualisieren, um zu überprüfen, ob die Reaktion funktioniert hat.
Kann ich das auf einem Agarosegel machen? Reicht es aus, einfach ein 1%iges TAE-Agarosegel mit EtBR herzustellen, das Sie für die routinemäßige DNA-Elektrophorese verwenden würden, und dieses auszuführen? Müssen besondere Maßnahmen gegen mögliche RNAsen im Gel oder im Laufpuffer getroffen werden?
Sie haben zwei Möglichkeiten: Wenn Sie nur schnell prüfen müssen, ob Ihre RNA in Ordnung ist und Sie tatsächlich nur eine Bande erhalten, können Sie eine „Quick and Dirty“-Methode ausprobieren. Erhitzen Sie die Probe für 5 Minuten auf 65°C und kühlen Sie sie dann sofort in einem Eisbad ab und halten Sie sie dort bis zum Beladen. Dadurch schmilzt man die Sekundärstruktur der RNA auf und hält sie in diesem Zustand. Sie werden dann höchstwahrscheinlich nur eine Band sehen.
Wenn dies nicht funktioniert oder Sie einen RNA-Größenmarker verwenden möchten, führt kein Weg an der denaturierenden Gelelektrophorese vorbei. Hier denaturieren Sie Ihre Probe im Ladepuffer und führen anschließend ein denaturierendes Gel ein, das die Sekundärstrukturen verhindert. Dazu gibt es eine gute Abhandlung:
Die klassische Methode mit Formaldehyd (die gefährlicher in der Handhabung ist) wird im folgenden Artikel und auch im Buch "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" von Maniatis und Kollegen beschrieben:
RNA ist faltbar, wodurch eine Sekundärstruktur entsteht und ihre Mobilität verändert wird (im Vergleich zu supercoiled DNA). Wenn Sie also Ihre RNA nicht angemessen denaturieren, wird sogar eine einzelne Spezies einen Abstrich produzieren.
Eine gängige Strategie besteht darin, denaturierende Chemikalien wie Formaldehyd in das Verfahren einzuarbeiten. Siehe dieses Protokoll von Life Technologies .
Anscheinend können Sie auch einfach ein Standard-DNA-Gel mit etwas zugesetztem Bleichmittel herstellen . Ich habe diese Technik nicht verwendet, aber sie haben einige Beispielergebnisse.
rhill45