Alternatives Protokoll zur Bewertung der RNA-Integrität unter Verwendung eines Bleichgels

Ich hasse es, MOPS-PFA-Agarosegele mit DEPC und allem laufen zu lassen, nur um meine RNA-Integrität zu überprüfen. Ich bin auf ein alternatives Protokoll gestoßen, das gewöhnliches Haushaltsbleichmittel im Gel verwendet, um RNasen zu hemmen, und habe mich gefragt, ob es hier jemand ausprobiert hat und wie der Erfolg war? Oder jeder hilfreiche Einblick ist ebenfalls willkommen.

Hier ist ein Protokoll, das ich basierend auf dem, was in diesem Papier gemacht wurde, zusammengestellt habe.

Für ein 50-ml-Gel IN einem RNase-freien 250-ml-Erlenmeyerkolben Mischen Sie: 5 ml 10x TAE, das ich Ihnen gegeben habe, 42,5 ml ultragereinigtes Wasser, 0,5 g der Agarose, die ich Ihnen gegeben habe, 2,5 ml Haushaltsbleiche (6 % Natriumhypochlorit, verwenden Sie Clorox).

5-10 Minuten inkubieren.

Mikrowelle für die minimale Zeit auf der niedrigsten Hitzeeinstellung, die benötigt wird, um die Agarose vollständig aufzulösen, Sie wollen keine Verdunstung Passen Sie das Volumen Ihrer Lösung an Überprüfen Sie Ihr Volumen mit einer sterilen serologischen 50-ml-Pipette, wenn Sie mehr als 5 % Volumen verloren haben I würde wiederholen, mit weniger Hitze.

3 µl 10 mg/ml Ethidiumbromid zugeben, zum Mischen schwenken. Gießrahmen einfüllen, abkühlen lassen, in 1xTAE tauchen

Kombinieren Sie 1 µg Ihrer Gesamt-RNA, 2 µg RNase-freie 6x-Loading-Farbe und qs zu 12 µl in RNAse-Feree-Wasser, Sie können dafür das Wasser aus dem Qiagen-Kit verwenden. Bei 100 V ca. 30 min laufen lassen, ein gutes gescanntes Bild davon erhalten und Photoshop verwenden, um die Bandintensität zu beurteilen. Das 28S sollte in einer Probe mit wenig bis gar keiner Fragmentierung doppelt so hell sein wie das 18S.

Ich hasste auch die denaturierenden Agarose-RNA-Gele, aber ich wechselte zu nativen Gelen mit Lithium-Borsäure-Puffer von Faster Better Media in 0,5-facher Konzentration. Meine Gele sehen viel besser aus, obwohl ich 2 Banden in jeder Spur bekomme, weil es nicht denaturiert ist. Wie verwenden Sie die Gele, um die RNA-Integrität zu überprüfen? Wenn ich eine Band in der richtigen Größe sehe, habe ich sie als gut genug bezeichnet und weitergemacht. Wie präzise muss ein Gel sein?
Betrachtet man die kleinen und großen Untereinheiten. Der große sollte in einer unfragmentierten Probe von Gesamt-RNA doppelt so hell sein. Das Gel darf keine Exonuklease-Aktivität aufweisen, nicht viel mehr als nötig
Vielleicht konnte ich deshalb mit meinen Gelen davonkommen, ich mache RNA durch In-vitro-Transkription, Sie müssen sie aus Zellen isolieren.
Du hast Recht!
Was ist Ihr ultimatives Ziel? Wozu braucht man RNA? Die Strenge des Tests hängt davon ab. Für die übliche RT-PCR erhitze ich die RNA mit dem 2x Ladepuffer, der Formamid enthält, und lasse sie in einem normalen Agarosegel mit TAE/TBE bei 120 V laufen.
Testen der RNA-Integrität für Microarray
Warum lässt man die RNA nicht einfach auf einem Nanofluidik-Gerät von Agilent Bioanalyzer (oder etwas Ähnlichem) laufen? Es ist ziemlich billig und schnell, und ich bin sicher, dass viele Kerndienste es jetzt anbieten. Natürlich mache ich hier bestimmte Annahmen über die Finanzierung und die Verfügbarkeit von Technologien ...
@Cantona'sCollar, das ist sicherlich der Goldstandard, aber ich verstehe nicht, wie billig diese Chips für die Masse, in der Sie sie kaufen müssen, eine sehr kurze Haltbarkeit haben. Außerdem hatte jede Flüssigkeitsmaschine das Potenzial für katastrophale Kosten.

Antworten (2)

Ich glaube nicht, dass Bleichmittel RNA denaturieren kann. Bleichmittel ist ein Oxidationsmittel und schädigt die RNA. Außerdem erwähnt das Protokoll die Zugabe von Hypochlorit vor dem Erhitzen, was meiner Meinung nach unlogisch ist, da es durch Hitze zersetzt wird.

Zum Testen der RNA-Integrität müssen Sie kein denaturierendes Gel herstellen. Stattdessen können Sie die RNA mit dem 2xRNA-Ladepuffer, der 95 % Formamid enthält, erhitzen und in einem normalen TBE/TAE-Agarosegel laufen lassen. Das Erhitzen mit Formamid denaturiert die RNA dauerhaft.

Denaturierende Gele sind nur für Northern Blots unerlässlich.

Sie können Ihre Probe auch in einem Bioanalyzer laufen lassen, um die RNA-Integrität zu überprüfen, und dies wird immer für RNAseq-Experimente empfohlen (sogar für Microarrays, aber ich kann nicht viel dazu sagen, weil ich es noch nie gemacht habe und die übliche Praxis nicht kenne).

Ich sage Ihnen, ich habe es auch nicht geglaubt, aber es funktioniert ganz gut. Fügen Sie es nicht der Agarose hinzu, bevor Sie es in die Mikrowelle geben, und verwenden Sie 6 %. Auch die RNA wird bereits bei den meisten Reinigungsverfahren denaturiert, insbesondere bei den Standardverfahren, die Guanidin verwenden. funktioniert gut für ein Lehrlabor (billig und einfacher) und ich denke, dieses Protokoll konzentriert sich auf die Entfernung oder Inaktivierung von RNAse. +1 für die Heizungsaufzeichnung, aber ich bin es leid, RNA zu erhitzen, es sei denn, es kann blitzschnell erhitzt werden. Ich kann dies jedoch das nächste Mal tun.

Das Bleichmittel dient nicht dazu, die RNA zu denaturieren, sondern um RNase zu zerstören, die möglicherweise in Ihrer Agarose oder Ihrem Puffer lauert - Hitze tötet RNase nicht so leicht ab, sodass das Kochen nicht hilft. Lassen Sie dann einfach ein normales Agarosegel (TAE/TBE oder Borat) laufen und sehen Sie sich die relativen Intensitäten der LSU- und SSU-RNA an. Die Bleichgele funktionieren sehr gut für mich und ich habe sehr gute RNA-Seq-Ergebnisse aus der auf diese Weise analysierten RNA (ich habe keinen Zugang zu einem Bioanalysegerät).

Bitte fügen Sie Ihrer Antwort einige Referenzen hinzu.
Alternatives Protokoll zur Bewertung der RNA-Integrität unter Verwendung eines Bleichgels
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v