Wie kann ich RNA nach der Gelelektrophorese aufreinigen, um restliches Acrylamid zu entfernen?

Manchmal verwende ich die denaturierende Gelelektrophorese im präparativen Maßstab, um RNA zu reinigen, die durch In-vitro-Transkription hergestellt wurde. Das Hauptproblem dabei ist, dass die Probe nach der Extraktion aus dem Gel immer noch erhebliche Mengen an Acrylamid oder Acrylamid-Oligomeren/Polymeren enthält.

Der Austausch des Puffers mit Vivaspins entfernt ihn nicht zuverlässig, das Ausfällen der RNA reduziert auch nur die Menge, kann das Acrylamid aber nicht vollständig entfernen.

In einigen Fällen stört das Acrylamid die späteren Experimente nicht sehr, aber es gibt einige Experimente, die mit Acrylamid in der Probe nicht funktionieren.

Welche Möglichkeiten gibt es, die RNA nach der Gelelektrophorese aufzureinigen, um Acrylamid zuverlässig aus der Probe zu entfernen? Vorzugsweise sollten sie einfach und schnell sein, nicht so etwas wie ein vollständiger FPLC/HPLC-Lauf.

Darf ich fragen, warum Sie Ihre in vitro transkribierte RNA aufreinigen müssen? Ich habe mRNA durch IVT hergestellt und gute Ergebnisse ohne jegliche Reinigung über die Phenol:Chloroform-Extraktion und Isopropanol-Präzipitation hinaus erzielt.
@ user137 Ich verwende die RNA selbst für NMR-Experimente, ich brauche sie in einem anderen Puffer und ohne DNA und Protein, um Spektren von guter Qualität zu erhalten. Und alles andere, was noch darin ist, wird wahrscheinlich einige der Signale der RNA überlappen.
Wie viel RNA benötigen Sie für NMR? Ich habe immer gehört, dass NMR viel Material für ein gutes Signal benötigt.
@ user137 Je nachdem, was genau Sie tun möchten, benötigen Sie etwa 0,2-1,0 mM Protein oder RNA in Ihrer Probe in einem Volumen von 300-500 Mikrolitern. Und für viele Experimente braucht man es auch 13C- und/oder 15N-markiert.
@MadScientist Vielleicht habe ich falsch gerechnet, aber 500 ul von 1 mM meiner mRNA (1860 Basen) wären 300 mg RNA. Selbst wenn 300 ul von 0,2 mM etwa 36 mg RNA wären. Mit einer guten In-vitro-Transkriptionsreaktion kann ich 200 ug RNA erhalten. Offensichtlich würde eine kurze RNA für die gleiche Molarität viel weniger Masse benötigen.
@ user137 Die RNA, die Sie mit NMR untersuchen würden, ist normalerweise etwa 15-150 nt lang, Sie sehen mit NMR nicht viel für etwas Größeres. Und wir führen die In-vitro-Transkriptionen einfach in einem größeren Maßstab durch, typischerweise um die 10-30 ml. RNA wird auch fast immer in Shigemi-Röhrchen gemessen, daher beträgt das Volumen 300 ul, und eine Konzentration von 1 mM ist zwar ideal, aber so viel kann man nicht immer bekommen.

Antworten (1)

Wenn Sie kein Acrylamid in Ihrer Zubereitung haben möchten, verwenden Sie es nicht, da Sie immer etwas Verschleppung in der Lösung haben werden. Und Sie werden es nicht vollständig los, da es zumindest teilweise mit den Nukleinsäuren copräzipitiert wurde (es wird zu diesem Zweck als Copräzipitationsmittel verwendet).

Ich denke, die beste Lösung ist die Verwendung von Chromatographie, entweder Größenausschluss oder geladene Harze. Weitere Informationen finden Sie in diesen beiden Papieren:

Wir verwenden auch chromatographische Methoden, aber die Gelreinigung hat bestimmte Vorteile wie eine bessere Auflösung. Auf Acrylamid muss ich nicht komplett verzichten, es würde reichen, es deutlich unter die RNA-Konzentration zu reduzieren.
Gel ist einfacher und schneller, Chromatographie hat eine bessere Auflösung und dauert länger. Jetzt müssen Sie entscheiden, was wichtiger ist ...
Ich vermute, dass nach dem Lauf noch unpolymerisiertes Acrylamid zurückbleibt. Erhitzen sollte Acrylamid zu gasförmigen Produkten (Ammoniak, Wasserstoff und Kohlenmonoxid) zersetzen. Siehe hier . Ich bin mir jedoch nicht sicher über die thermische Zersetzung (keine solide Referenz).
Wie kann ich RNA nach der Gelelektrophorese aufreinigen, um restliches Acrylamid zu entfernen?
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