Well-to-Well-Variation in der Thermocycler-Fluoreszenz?

Wir haben einen alten BioRad ICycler Thermocycler mit MyIQ Einfarben-Fluoreszenzdetektor. Obwohl es für RT-PCR gedacht ist, haben wir es für Schmelzkurven und Bindungsassays für verschiedene RNA-Typen mit Thiazolorange als interkalierendem Fluorophor verwendet. Als wir jedoch versuchten, diesen Assay ernst zu nehmen und die Dinge dreifach durchzuführen, stellten wir fest, dass die Schwankungen von Bohrloch zu Bohrloch schrecklich waren, was es schwierig machte, eine statistische Signifikanz zu erhalten.

Nachdem ich das Handbuch durchgelesen hatte, versuchte ich, "beständige Brunnenfaktoren" für das Instrument zu erhalten, um diese Variation zu korrigieren. Das Protokoll des Instruments erfordert hierfür jedoch eine Erwärmung auf 95 °C, sodass die Interkalation von Fluorophoren nicht funktioniert, die RNA schmilzt und die Fluoreszenz verloren geht, also habe ich es mit Fluorescein versucht. Dies löste die Variation nicht.

Also versuchte ich, meine eigenen Brunnenfaktoren herzustellen, indem ich 10 ml Poly(rA) Poly(rU) RNA-Lösung mit Thiazolorange herstellte und 96 PCR-Röhrchen mit jeweils 100 µl füllte und die Fluoreszenz maß. Dann berechne ich die durchschnittliche Fluoreszenz und dividiere den Durchschnitt durch den Wert für jede Vertiefung, um einen Faktor F für jede Vertiefung zu bestimmen. Dann versuchte ich, nachfolgende Experimente zu normalisieren, indem ich die Fluoreszenz jeder Vertiefung mit ihrem F multiplizierte, um einen korrigierten Wert zu erhalten. Dies reduziert zwar die Variation ein wenig, ist aber immer noch ziemlich schlecht.

Haben Sie Vorschläge, um die Schwankungen von Bohrloch zu Bohrloch in diesen Experimenten zu reduzieren oder die Daten anderweitig zu korrigieren?

Ich habe keine Erfahrung mit RT-PCR-Instrumenten, alles, was ich darüber weiß, stammt aus dem Herumspielen mit dem Instrument. Ich weiß nicht, ob ich etwas wirklich grundlegendes übersehe.

Schritt für Schritt Protokoll

1. Vorbereiteter 1xSSC-Puffer, 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,5
2. Abgewogen 5 mg Thiazol Orange, gelöst in 1 ml Methanol
3. 1000-fach verdünntes Thiazol Orange in 1xSSC
4. Nahm 71,4 µl (100 µg) Poly(rU) Poly(rA)-Lösung, 1,4 µg/µl
5. Verdünnte RNA mit 8,93 ml 1xSSC
6. 100 µl verdünntes Thiazol Orange zu verdünnter RNA hinzugefügt, Endvolumen 10 ml
7. Richten Sie 96 PCR-Röhrchen ein, verwenden Sie eine 8-Kanal-Pipette und einen Trog, um jeweils 100 µl RNA-Lösung zu übertragen
8. Platzierte PCR-Röhrchen in allen 96 Positionen des Thermocyclers
9. Schmelzkurvenprotokoll ausführen, bei 25⁰C beginnen, bei jedem Zyklus um 1⁰C erhöhen, 60 Zyklen, sodass die Endtemperatur 85⁰C beträgt. Jeder Zyklus dauert 10 Sekunden. Messen Sie die Fluoreszenz in jedem Zyklus.
10. Wiederholte Schmelzkurve 3 Mal, insgesamt 4 Kurven.
11. Geben Sie Daten aus jeder Kurve in die Tabelle ein. 96 Datenpunkte bei jeder Temperatur.
12. Gemittelte Fluoreszenz über die gesamte Platte bei jeder Temperatur. Verwenden Sie diese Durchschnitts-, Standardabweichungs-, Maximal- und Minimalwerte, um die folgenden Diagramme zu erstellen.
13. Berechnete Korrekturfaktoren für jede Vertiefung bei jeder Temperatur durch Dividieren der durchschnittlichen Fluoreszenz der gesamten Platte durch die Fluoreszenz jeder Vertiefung für die Schmelzkurven 2, 3 und 4. Gemittelte Korrekturfaktoren aus jeder Kurve.
14. Berechnete korrigierte Fluoreszenz für die Kurven 1, 2, 3 und 4 durch Multiplizieren des gemittelten Korrekturfaktors für jede Vertiefung mit der beobachteten Fluoreszenz für diese Vertiefung.
15. Die korrigierten Werte wurden neu gezeichnet, um die reduzierte Streuung zu zeigen.

Die Daten sind unten gezeigt. Ich habe die Schmelzkurve 4 Mal wiederholt, weil das erste Schmelzen normalerweise eine geringere Intensität hat als nachfolgende Schmelzen. Die Y-Achse ist die Fluoreszenz, die X-Achse ist die Temperatur in Celsius, und ich habe die durchschnittliche Fluoreszenz bei jeder Temperatur mit der Standardabweichung zusammen mit dem Minimum und Maximum aufgetragen, um zu zeigen, wie weit einige Vertiefungen außerhalb der Standardabweichung liegen. Ich habe die Korrekturfaktoren für die Schmelzkurven 2, 3 und 4 berechnet und gemittelt. Als ich diese gemittelten Faktoren auf die Schmelzkurven 2, 3 und 4 verwendete, leistete es gute Arbeit bei der Eliminierung von Variationen. Als ich die Korrekturfaktoren auf Schmelzkurve 1 anwendete, reduzierte dies die Variation, aber nicht viel.