Wie reinige ich mit Phenol kontaminierte RNA, ohne etwas von der Probe zu verlieren?

Ich habe kürzlich im Rahmen eines sehr langen und intensiven Experiments zum ersten Mal RNA aus sich entwickelnden Pflanzenblättern extrahiert. Die Proben waren aufgrund des Aufwands, der für ihre Gewinnung aufgewendet wurde (Tausende von winzigen Blättern, eines von jeder Pflanze, um die erforderliche Masse zu erhalten), äußerst wertvoll.

Ich habe die RNA mit TRIzol und Chloroform extrahiert. Nanodrop zeigte eine hervorragende Ausbeute, wie man es für aktiv wachsendes junges Gewebe erwarten würde, aber einige der Proben hatten wirklich niedrige 260/230-Verhältnisse. Ich weiß, dass dies auf eine Phenol- oder Salzkontamination hindeutet, aber was kann ich tun, um die Proben zu reinigen, ohne dass etwas von der wertvollen RNA verloren geht? Und wie kann ich die Kontamination in Zukunft vermeiden?

Antworten (2)

Sie können Phenol reinigen, indem Sie mit Chloroform waschen und dann eine Isopropanol-Fällung durchführen, gefolgt von einer 75%igen EtOH-Waschung (lassen Sie es mich wissen, wenn Sie ein genaues Protokoll wünschen).

Um Kontamination (und Probenverlust) zu vermeiden, müssen Sie beim Pipettieren akribisch sein (was Sie mit Übung besser werden). Sie können immer diese Phase-Lock-Röhrchen verwenden, die im Grunde ein festes Gel zwischen der wässrigen und der organischen Phase einklemmen, sodass es viel einfacher zu pipettieren ist.

Welcher Teil des Pipettierens ist der entscheidende Teil? Ist es die Entfernung der klaren Oberphase nach der Zentrifugation? Wenn ja - lassen die meisten Menschen etwas von der oberen Phase zurück, um eine Kontamination zu vermeiden? Ich habe versucht, jeden letzten Tropfen zu bekommen!
@RichardSmith Ja, das Pipettieren der organischen/wässrigen Phase ist entscheidend. Es hängt davon ab, (1) wie gut Sie beim Pipettieren sind und (2) wie "wertvoll" Ihre Proben sind. Wenn Sie jedoch sorgfältiger darauf achten, so viel Probe wie möglich zu erhalten, gibt es natürlich einen Kompromiss zwischen Ausbeute und Reinheit. Wenn ich etwas Probe entbehren kann, lasse ich normalerweise nur ein winziges Stück übrig, um es mir zu ersparen, den Müll in der Interphase zwischen den beiden Schichten zu berühren.
Ich kann doch nicht so gut pipettieren, wie ich dachte! Vielen Dank für Ihre Antwort. Ich werde dafür sorgen, dass ich beim Pipettieren besser werde, und in der Zwischenzeit lasse ich eine sichere Menge der wässrigen Phase zurück.
@RichardSmith Es war vielleicht nicht ganz deine Schuld. Das Standardverfahren besteht darin, die RNA mit Isopropanol und Ethanol zu reinigen, was Sie anscheinend nicht getan haben. Sobald Sie das getan haben, sollten Sie supersaubere RNA erhalten, selbst wenn es beim Pipettieren eine Unebenheit gab.
Ich habe mit Isopropanol und Ethanol gereinigt und danach Nanodropped. Ich übernehme die volle Verantwortung!
@ jp89, Soweit ich weiß, kümmern sich die IPA- und Ethanol-Reiniger nur effektiv um die Salze. Die Phenol-Choloform-Extraktion leistet eine viel bessere Arbeit bei der Entfernung von Proteinen. Eventuell könntest du etwas von der Zwischenphase nehmen und nochmal putzen. Das Phenol wirkt sich auf Ihre Säulen und Ihre Ausbeute aus.
Um alle Spuren von Phenol loszuwerden, versuchen Sie auch, mit Äther zu extrahieren.

Eine Ethanolfällung sollte funktionieren. Aber ich hatte große Erfolge mit den Qiagen RNA-Reinigungssäulen, die meiner Meinung nach einfacher sind. Hier ist eine URL, um die von Qiagen angebotenen RNA-Reinigungssäulen anzuzeigen: http://www.qiagen.com/products/rnacleanupconcentration/default.aspx

Auch in Zukunft sollten Sie den Einsatz von PhaseLock Röhrchen in Erwägung ziehen:

http://www.5prime.com/products/nucleic-acid-purification/organic-nucleic-acid-extraction/phase-lock-gel-.aspx

Das hat mich viele Male davor bewahrt, genau dein Problem zu haben.

vielen Dank für die Antwort und die Links. Ich behalte die PhaseLock-Röhrchen im Auge - ich nehme es mit dem PhaseLock. Ich brauche das Reinigungsset nicht?
Oh, und willkommen bei biology.SE :)
Vielen Dank. Ich habe gerade mit der Home Brewing.SE angefangen und gesehen, dass es auch eine Biologie gibt. Scheint eine gute Idee zu sein. ;-)
Wie reinige ich mit Phenol kontaminierte RNA, ohne etwas von der Probe zu verlieren?
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