Was sind die Vor- und Nachteile der Verwendung von Beta-Galactosidase im Vergleich zu Luciferase als Reportergen?

Beta-Galactosidase (kurz B-Gal) ist ein Enzym, das das Substrat Laktose verarbeitet. Bei Anwendungen, bei denen B-Gal als Reporter (lacZ-Gen) verwendet wird, werden üblicherweise zwei Laktoseanaloga verwendet: X-Gal oder ONPG (wie von @Alan Boyd hervorgehoben). Beide Substrate sind farblos und werden gefärbt, sobald sie durch B-Gal hydrolysiert werden. Die Bildung dieser Farbe ermöglicht es, B-gal entweder durch visuelle Untersuchung oder durch genauere Mittel unter Verwendung eines Spektrophotometers oder einer Kamera zu untersuchen.

Wenn X-Gal hydrolysiert wird, wird ein unlöslicher blauer Farbstoff gebildet. Die Entwicklung der blauen Farbe wird intensiviert, wenn mehr Substrat hydrolysiert wird, was ein schnelles Blau/Weiß-Screening durch visuelle Inspektion bei üblichen Anwendungen des Klonens und der Genexpression ermöglicht. Unter Verwendung des X-Gal-Substrats sind B-Gal-Assays empfindlicher für die Genexpression (der Farbstoff fällt aus und behält die Farbe sehr gut), jedoch ist X-Gal nicht quantitativ ( Möckli & Auerbach. BioTechniques 36:872-876 (Mai 2004). )). Im Gegensatz dazu entwickelt die ONPG-Hydrolyse einen löslichen gelben Farbstoff. Diese Farbentwicklung ist quantitativ, jedoch weniger empfindlich als X-gal, da der lineare Zusammenhang zwischen Lichtabsorption (bei 420 nm) und Substratkonzentration gering ist. Die Verwendung von ONPG als B-Gal-Substrat ermöglicht die quantitative Messung der B-Gal-Aktivität (und daher der Promotoraktivität). (Beachten Sie, dass ONPG selbst im Gegensatz zu X-gal nicht in der Lage ist, den lac-Promotor zu induzieren.)

Luciferase-Reporter (es gibt tatsächlich ein paar verschiedene luc-Gene) arbeiten auf ähnliche Weise. Das Enzym spaltet sein Substrat, gibt aber statt eines unlöslichen blauen Farbstoffs ein charakteristisches Photon ab. Die Luciferase-Aktivität muss mit spezieller Kamerahardware gemessen werden, um die von Ihren Hefeklonen emittierten Photonen zu erkennen und zu zählen. Dieser Assay beantwortet immer noch Ja/Nein-Fragen des Reporters, kann aber auch quantifiziert werden, um zu sehen, wie stark der Reporter aktiviert wurde. Die Luciferase-Aktivität ist ein quantitativer Reporter, während sie auch räumlich-zeitliche Informationen liefert.

Die Wahl der Reporter hängt weitgehend von der Frage ab, die Sie beantworten möchten. Wenn Promotor-Induktion relevant ist (z. B. wurde der Stress-Response-Promotor aktiviert), dann sind Luciferase oder B-Gal mit X-Gal aufgrund ihrer höheren Sensitivität am besten geeignet. Da für Luciferase eine spezielle Kamera und ein optischer Filter (z. B. ein Geldokumentationssystem) erforderlich sind, ist X-Gal ideal, da es mit dem Auge überprüft werden kann. Wenn die Promotoraktivität getestet wird, dann liefert B-gal + ONPG oder Luciferase quantitative Messungen der Reportergenaktivität und erfordert mindestens ein Spektrophotometer.

Da es sich um Universitätslabore handelt, nehme ich an, dass die Materialkosten minimiert und die Einfachheit des Versuchsprotokolls maximiert werden sollen, ist B-gal der ideale Reporter. Luciferase erfordert: teureres Substrat; spezielle Ausrüstung; sorgsamer Umgang mit Materialien und mehr Zeit (da das Screening notwendigerweise länger dauert, daher geringerer Durchsatz für eine Laborvorführung).

Ich denke, dass @leonardo das verkehrt herum hat. β-Galactosidase kann unter Verwendung von ONPG als kolorimetrisches Substrat ohne Löslichkeitsprobleme genau und kostengünstig getestet werden. Alles, was benötigt wird, ist ein Spektrophotometer: Ich vermute, dass dies der Assay ist, den das OP in seinem Experiment verwendet hat. Meine Antwort lautet also - verwenden Sie β-Galactosidase für eine kostengünstige quantitative Analyse - es ist nicht erforderlich, Luciferin und ATP hinzuzufügen oder sich um die Verfügbarkeit von Sauerstoff zu sorgen. Ich kann mir kaum einen Nachteil für β-Gacosidase vorstellen - vielleicht gibt es höhere Hintergrundwerte von anderen zellulären Glykosidasen, während es keine Hintergrundaktivität von Luciferase gibt?

Mir ist klar, dass es bei dieser Frage um Hefe geht, aber ich fürchte, dass die Leute versuchen könnten, die Antwort auf alle Systeme auszudehnen, und Beta-Galactosidase ist nicht für alle Systeme gut, insbesondere für Tierversuche. Ich habe zu viele Gentherapie-Papiere gesehen, die versuchen, damit davonzukommen.

Beta-Galactosidase ist kein gutes Reportergen für In-vivo-Genabgabestudien. In den meisten Geweben gibt es zu viel endogene Aktivität, um die exogene Aktivität zu unterscheiden. Bei der nicht viralen Genabgabe ist die Menge an exprimierter DNA oft so gering, dass Sie die endogene Aktivität nicht überwältigen können und daher nicht schlüssig sagen können, dass die von Ihnen nachgewiesene Enzymaktivität von Ihrer neuen DNA stammt.

Luciferase ist für In-vivo-Arbeiten weit überlegen. Erstens gibt es bei den meisten Tieren keine endogene Luciferase-Aktivität (Sie haben Pech, wenn Sie an Glühwürmchen arbeiten), sodass Sie sicher sein können, dass jede Luciferase-Aktivität, die Sie entdecken, echt ist. Die Luciferase-Aktivität kann nicht-invasiv durch Biolumineszenz-Bildgebung bestimmt werden, was wiederholte Messungen am selben Tier ermöglicht. Beta-Glucosidase kann das Töten des Tieres, das Sezieren des Gewebes, das Präparieren von Mikroskop-Objektträgern und die anschließende Analyse erfordern, sodass für eine Zeitverlaufsstudie die Verwendung von viel mehr Tieren erforderlich ist.

Der einzige Vorteil, den Beta-Glucosidase gegenüber Luciferase hat, ist, wenn Sie sehen möchten, wie viel Prozent oder genau welche Art von Zellen das Reportergen exprimieren. Ich denke jedoch, dass GFP oder ein anderes fluoreszierendes Protein aufgrund des Problems der endogenen Aktivität, das ich zuvor beschrieben habe, besser geeignet wäre.

Auch hier gilt meine Antwort für den Tiergebrauch. Wenn Sie nur Hefe auf einem Teller züchten, ist die Beta-Galactosidase wahrscheinlich der billigere Weg. Wir haben einige 384- und 1536-Well-Platten-Assays an primären Hepatozyten mit Luciferase durchgeführt, und das Luciferase-Reagenz kostete etwa 250 US-Dollar für 10 ml. Sie können auch fluoreszierende Proteine ​​für das Screening in Betracht ziehen. Ich habe Bakterienkolonien mit RFP hergestellt, die sichtbar rot waren, also kein Bedarf an UV, aber selbst wenn Sie UV-Licht benötigen, um die Fluoreszenz zu sehen, ist ein Standard-UV-Transluminator zum Betrachten von Gelen gut genug und es müssen keine zusätzlichen Reagenzien hinzugefügt werden.