Ich habe also einen E.coli-Stamm, der phänotypisch resistent gegen die Antibiotika Ampicillin und Rifampicin ist. Wie teste ich, ob das AmpR-Gen auf einem Plasmid und nicht auf dem Chromosom vorhanden ist?
Zusammenfassend dachte ich, Sie könnten vielleicht das Plasmid isolieren, es in ein Ampicillin-empfindliches Bakterium einbringen und dann sehen, ob das Bakterium stirbt oder nicht.
Ich dachte auch, Sie könnten PCR auf dem Plasmid mit Primern verwenden, die komplementär zu Sequenzen neben dem AmpR-Gen sind. Ich würde eine Positivkontrolle mit dem interessierenden Gen und eine Negativkontrolle ohne Vorlage verwenden.
Klingen diese ungefähr richtig und gibt es andere Methoden oder Kontrollen, die ich in Betracht ziehen sollte?
Basierend auf der von Ihnen beschriebenen Situation wäre die Isolierung des Plasmids aus dem Ampicilin-resistenten E. coli-Stamm und die Aufnahme durch einen separaten, nicht resistenten E. coli-Stamm die effizienteste und kostengünstigste Methode zu bestimmen, ob sich das AmpR-Gen auf dem Plasmid oder dem Bakterienchromosom selbst befindet oder nicht.
Dazu müssten Sie zunächst eine Kultur des Ampicilin-resistenten Stamms züchten, aus der Sie die Lyse von Zellen induzieren könnten, um eine Lösung zu erhalten, die freie Plasmide enthält.
Es gibt mehrere verschiedene Plasmid-Isolierungs- oder Mini-Prep-Verfahren, die typischerweise recht effektiv sind, wenn sie richtig durchgeführt werden.
Darüber hinaus gibt es viele spezifische "Plasmid-Isolierungs"- und "Plasmid-Reinigungs"-Kits, die die Materialien und Anweisungen enthalten, die für diesen Prozess erforderlich sind: Isolierung Ihrer Addgene-Plasmid-DNA aus Bakterien
Nachdem Sie das Plasmid aus Ihrem Ampicilin-resistenten Stamm richtig isoliert haben, müssten Sie dieses Plasmid dann in einen nicht-resistenten E. coli-Stamm einfügen. Bakterientransformation durch Elektroporation ist eine häufig verwendete Technik, die eine erhöhte Permeabilität von Bakterienzellmembranen bewirkt, wodurch das Plasmid in die Zellen eindringen oder von diesen aufgenommen werden kann.
Sobald sich diese Zellen "erholen" konnten, können sie in flüssiger oder fester Kultur, die Ampicilin enthält, gezüchtet werden. Wachstum würde anzeigen, dass das AmpR-Gen im Bakterienstamm vorhanden ist und dass das Plasmid für das Tragen dieser Resistenz verantwortlich ist. Ebenso würde kein Wachstum darauf hindeuten, dass das Gen stattdessen auf dem Bakterienchromosom vorhanden gewesen sein muss.
ein weiterer 'Homo sapien'
Chris