Restriction Mapping - Hausaufgabenfrage

Ich habe Probleme bei der Lösung dieser Übung.

Übung

Ein kreisförmiges Plasmid von 10.000 Basenpaaren (bp) wird mit zwei Restriktionsenzymen, A und B, verdaut, um eine 3000 bp- und eine 2000 bp-Bande zu erzeugen, wenn sie auf einem Agarosegel sichtbar gemacht werden. wenn jeweils mit einem Enzym verdaut wird, ist nur eine Bande bei 5000 bp sichtbar. Wenn die erste Stelle für Enzym A(A1) an der 100. Base vorhanden ist, ist die Reihenfolge, in der die verbleibenden Stellen (A2, B1 und B2) vorhanden sind, &agr;

Warum ich mit dieser Übung zu kämpfen habe

Wie kann ein 10.000-bp-Plasmid 3000 bp und 2000 bp nur auf Agarosegel produzieren? Ich meine, wo sind die restlichen 5000 bp? Ich weiß nicht, ob mein Konzept richtig ist.

Linearisierte Banden auf einem Agarosegel können doppelt sein. Das kann die Zweifel im Problem beseitigen. Aber ich weiß immer noch nicht, wie ich eine vernünftige Restriktionskartierung durchführen und die Stellen verschiedener Enzyme herausfinden soll.

Ich habe Ihre Frage so bearbeitet, dass sie kürzer, leichter zu lesen und zu verstehen ist und etwas weniger dramatisch klingt!

Antworten (1)

Das ist gar nicht so schwer, wie es zunächst scheint. Schauen wir uns zunächst die einzelnen Enzymverdaus an: Der Verdau mit Enzym A und B führt nur zu Produkten, die 5kB (5000 bp) voneinander entfernt sind. Da sie gleich groß sind, erscheinen beide gleich großen Restriktionsfragmente als eine Bande. Jedes Enzym schneidet also das Plasmid exakt in zwei Hälften.

Der doppelte Digest ist etwas kniffliger, aber nicht viel. Sie erhalten zwei Produkte davon, mit 2kB und 3kB. Dies bedeutet, dass Enzym B zwischen den Restriktionsstellen für Enzym A schneidet, was zu diesen beiden Fragmenten führt. Schauen Sie sich die Skizze an, die ich unten gemacht habe (nur eine schnelle und nicht maßstabsgetreu):Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

A1 und A2 sind die Schnittstellen für Enzym A, B1 und B2 die Schnittstellen für Enzym B. Die Zahlen außen sind die Positionen auf der DNA-Sequenz. Sie können sehen, dass ein einzelner Digest zu zwei Fragmenten von 5 kB führt (egal welche) und dass sowohl die A- als auch die beiden B-Sites 5 kB voneinander entfernt sind.

A1 steht auf Position 100, A2 muss auf Position 5100 stehen, B1 liegt 2kB hinter A1 (und damit auf Position 2100) und B2 2kB hinter Position A2 (und damit auf Position 7100). Um das gleiche Restriktionsmuster zu erhalten, ist es auch möglich, dass B1 und B2 3 kB hinter ihrer jeweiligen Enzym-A-Position liegen (also bei 3100 und 8100) und Sie immer noch das gleiche Muster von 2 kB und 3 kB auf dem Gel erhalten.

Restriction Mapping - Hausaufgabenfrage
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