Wie kann eine rechnerisch ermittelte dreifache Geninteraktion biologisch validiert werden? Welche Art von Assays oder Tests müssen mit Zell-/Gewebe-basierten und/oder Mausmodellen durchgeführt werden, um zu beweisen, dass die drei Gene tatsächlich eine gemeinsame Wirkung haben können?
Nehmen wir an, es ist einfacher, Geninteraktionen zu identifizieren und zu validieren, an denen Transkriptionsfaktoren wie FOXM1 beteiligt sind. Betrachten Sie eine Drei-Wege-Geninteraktion bei Brustkrebs – FOXM1-BUB1-CHEK1 – die auf direkte Wechselwirkungen über Western Blot und Reporter-Assays getestet werden kann. Aber solche Wechselwirkungen können interessant sein oder auch nicht - angesichts der Tatsache, dass Transkriptionsfaktoren das Expressionsniveau anderer Gene beeinflussen können. Die meisten Computerstudien konzentrieren sich auf die Identifizierung von Geninteraktionen auf der Grundlage von Koexpression oder Co-Auftreten. Es gibt Literatur zum rechnerischen Identifizieren von UND/ODER-Beziehungen zwischen interagierenden Genen. Ich habe kein spezifisches Beispiel, aber um der Argumentation willen, wenn wir vermuten, dass drei Gene auf UND-ähnliche Weise interagieren, wie validieren wir diesen Befund biologisch? ICH'
Danke
Halte durch, diese Antwort wird mit der Zeit wachsen.
Ich denke, wir könnten ein kleines Buch (oder einen sehr langen Übersichtsartikel) schreiben, um sowohl die Tiefe als auch die Breite Ihrer Frage(n) abzudecken.
Zuerst müssen wir einige Begriffe definieren und/oder klären. Der Begriff Interaktionbedeutet wahrscheinlich für verschiedene Autoren zu verschiedenen Zeiten unterschiedliche Dinge. Tatsächlich kann ein Autor diesen Begriff verwenden, um verschiedene Dinge zu verschiedenen Zeiten zu bedeuten. Deshalb möchte ich vorschlagen, dass wir einige Unterscheidungen treffen. Zum Beispiel würde ich zwischen einer genetischen Interaktion zwischen zwei Genen (die typischerweise in einem der Modellorganismen durch einen genetischen Test zwischen zwei Loss-of-Function-Allelen nachgewiesen wird) und einer Protein-Protein-Interaktion (manchmal auch als a PPI) zwischen den beiden Proteinen, die von denselben beiden Genen kodiert werden. PPIs wurden klassischerweise durch Co-Sedimentation in einem Saccharose-Dichtegradienten oder Co-Immunpräzipitation (Co-IP) oder durch Affinitätschromatographie nachgewiesen. In jüngerer Zeit wurden PPIs durch Massenspektrometrie (MS) (manchmal gekoppelt mit Affinitätschromatographie) nachgewiesen. PPIs wurden durch die Verwendung von Proxy-Assays abgeleitet,
PPIs können auch durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Assays nachgewiesen werden, und es kann durchaus andere geben.
Also, wenn Sie Gen-Gen-Interaktionen sagen, was genau meinen Sie damit?
Ich werde versuchen, so viele Szenarien abzudecken, wie ich mir vorstellen kann:
Geninteraktion (= Koexpression):
Dies ist wahrscheinlich am einfachsten zu validieren (z. B. durch Western Blot, wie Sie erwähnt haben), aber am schwierigsten zu interpretieren. Ohne weitere Analyse der Genfunktionen haben Sie keine Ahnung, welche Auswirkungen ihre gleichzeitig auftretende Aktivität haben könnte. Wenn die Gene metabolische Enzyme oder Teil einer Signalkaskade sind, wäre es eine gute Idee, sowohl ihre individuelle Rolle in diesen Signalwegen als auch mögliche synergistische Effekte zu überprüfen. Dasselbe gilt im Prinzip auch für Transkriptionsfaktoren, aber in diesem Fall werden „Wege“ oft nicht so gut verstanden, sondern gehen nach:
Geninteraktion ( = auf gleiche Targets):
Bei koexprimierten Transkriptionsfaktoren (aber auch zB Kinasen/Phosphatasen) ist es nicht abwegig, dass sie auch auf die gleichen Targets einwirken. Hier müssen Sie wieder beide Einzelwirkungen (Auflistung hoch-/runterregulierter Gene) mit synergistischen Wirkungen vergleichen (zB GenA verhindert die normale Funktion von GenB, GenC erhöht die Funktion von GenB um ein Vielfaches). Für die Analyse von Transkriptionsfaktoren sollten Sie generell die Expression auf mRNA-Ebene (über qPCR) analysieren, da die Proteinebene (mindestens) eine weitere Regulationsebene einführt.
Protrein-Wechselwirkungen:
Eine gute Möglichkeit, diese experimentell zu beweisen, sind Co-IP-Experimente (Immunpräzipitation): Sie verwenden einen Antikörper, um ein bestimmtes Protein und alle seine (direkten) Bindungspartner festzuhalten. Dann zeigen Sie mit einem Western Blot die Anwesenheit der Partner, für die Sie sich interessieren.
Eine Einschränkung für diese Methode mit 3-Wege-Wechselwirkungen (oder höherer Ordnung) ist, dass es – abhängig von der Bindungsstärke der Proteine – sehr schwierig sein kann, zu verhindern, dass irgendetwas anderes als direkte Interaktionspartner mitgereinigt werden. Wenn Sie unbedingt beweisen wollen, dass zwei Proteine direkt interagieren, ist ein Hefe-2-Hybrid-Experiment (y2h) besser geeignet.
Andere haben viel mehr Boden abgedeckt, aber ich werde ein paar Ansätze von der Spektroskopieseite einwerfen, da ich sie kürzlich betrachtet habe.
Biolumineszenz-Resonanzenergietranser (BRET) zeigt, ob Proteine in vivo binden: „BRET misst die Wechselwirkung von Proteinen unter Verwendung eines biolumineszierenden Donors, der mit einem interessierenden Protein fusioniert ist, und eines fluoreszierenden Rezeptors, der mit seinem Bindungspartner fusioniert ist. Der biolumineszente Donor, normalerweise eine Luciferase, tut dies regt das Fluorophor nicht mit Licht an, sondern überträgt Resonanzenergie durch Dipol-Dipol-Kopplung. Um Resonanzenergie zu übertragen, muss sich der Donor innerhalb von 10 nm vom Rezeptor und in der richtigen Ausrichtung befinden, wodurch die Technik für die Messung von Proteinen in unmittelbarer Nähe nützlich ist. (Von https://www.promega.com/resources/pubhub/features/bret-nanoluc-luciferase-and-protein-protein-interactions/ )
Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR) zeigt auch, ob Proteine binden, aber in vitro: „SPR reagiert empfindlich auf Änderungen des Brechungsindex innerhalb von etwa 150 nm von der Sensoroberfläche. Um die Wechselwirkung zwischen zwei Bindungspartnern zu untersuchen, wird ein Partner an die Oberfläche gebunden und das andere wird in einem kontinuierlichen Fluss von Probenlösung über die Oberfläche geleitet.Die SPR-Reaktion ist direkt proportional zur Änderung der Massenkonzentration nahe der Oberfläche.Biacore-Systeme können verwendet werden, um Wechselwirkungen zu untersuchen, an denen (im Prinzip) jede Art von Molekül beteiligt ist , von organischen Wirkstoffkandidaten bis hin zu Proteinen, Nukleinsäuren, Glykoproteinen und sogar Viren und ganzen Zellen." (Aus dem Biacore-Assay-Handbuch)
Dies sind beide Möglichkeiten, direkte Interaktion, dh Bindung, zu betrachten. Funktionale Interaktion ist eine ganz andere Geschichte.
mdperry
mdperry
Coolfunk