Mit welchen Tools kann ich feststellen, ob ein pflanzenhomologes Protein auf die gleiche Weise mit einer ncRNA interagiert?

Erster Post hier, also bloß mit mir, wenn ich gegen irgendwelche Etikette oder Formatierungsregeln verstoße.

Nehmen wir an, ich habe ein menschliches Protein. Wenn es mit einer beim Menschen gefundenen ncRNA interagiert, tut es etwas, das mich sehr interessiert. Ich sehe ein hochgradig homologes (~85 % AA-Identität) Protein in Pflanzen, und es ist weitgehend konserviert. Ich bin daran interessiert, die gleiche Aktivität dieses Proteins in Pflanzen hervorzurufen. Das einzige Problem ist, dass es keine native, von Pflanzen produzierte ncRNA gibt, die auf die gleiche Weise mit meinem interessierenden Protein interagiert. Da hatte ich eine Idee:

Was ist, wenn ich Pflanzen ein Transkript einführe, das dieses Problem anspricht? Wenn die pflanzliche Version dieses Proteins mit dieser (eingeführten) RNA auf die gleiche Weise interagiert, wird es wirklich cool. Ich möchte diese Hypothese mit einigen synthetisierten Konstrukten testen. Aber bevor ich Tausende von Dollar in ein paar Konstrukte stecke, würde ich gerne irgendwelche Vorhersage- oder Analysewerkzeuge untersuchen, um den Fall zu untermauern. Ich bin mir bewusst, dass die Chancen gegen mich stehen.

Danke!

Mir fallen keine Vorhersagewerkzeuge ein, aber ich denke, Sie sollten das System zuerst so weit wie möglich vereinfachen. Anstatt zu versuchen, die ncRNA in Pflanzen zu exprimieren, erhalten Sie das gereinigte Pflanzenprotein und die gereinigte ncRNA, vielleicht durch In-vitro-Transkription. Mischen Sie die beiden zusammen und sehen Sie, ob Sie Copräzipitation oder Vernetzung oder etwas verwenden können, um nach Bindung zu suchen. Fluoreszenzanisotropie könnte cool sein, wenn Sie ein Fluoremeter mit Polarisatoren haben, Sie könnten die RNA mit einem Fluorophor markieren und dann die Taumelrate messen, sobald es das Protein bindet, sollte das Taumeln verlangsamen. Verwenden Sie das menschliche Protein als Kontrolle.

Antworten (1)

Die ncRNA-Sequenz des Menschen kann an das Pflanzenprotein in den Pflanzenzellen binden, aber na und? Sie können vielleicht sagen, dass das Pflanzenprotein als RNA-bindendes Protein fungiert, aber nicht mehr. Ein weiteres Problem ist, dass das Pflanzenprotein möglicherweise nicht dieselbe RNA-Sequenz wie das menschliche Protein erkennt.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, RNA-Partner von RNA-bindenden Proteinen zu finden.

SELEX

Diese Methode wird verwendet, um Konsensussequenzen zu finden, die Ihr Protein in vitro erkennt. Sobald Sie Konsensussequenzen gefunden haben, können Sie nach ncRNAs aus der Pflanze suchen.

CLIP

Dies ähnelt dem Chip-Assay. Sie könnten echte Ziele Ihrer RNA-bindenden Proteine ​​finden

Mit meinem experimentellen Plan plane ich, ein Reporter-Transkript zu verwenden. Ich werde mehr sagen können als "es ist ein RNA-bindendes Protein". Meine Hauptsorge ist genau, dass das "Pflanzenprotein möglicherweise nicht die gleiche RNA-Sequenz wie das menschliche Protein erkennt", wenn überhaupt. SELEX und CHIP werden mir hier wahrscheinlich bei meinem Ziel helfen. Vielen Dank für Ihre Vorschläge.
Ich würde SELEX vorsichtig verwenden, um endogene RNAs zu finden, die das Protein binden, es würde wahrscheinlich ein RNA-Aptamer finden, das das Protein gut bindet, aber es gibt keine Garantie dafür, dass die resultierende RNA tatsächlich auf relevante Weise binden würde oder nur ein Roman wäre Sequenz, die zufällig gut bindet. In der Lage zu sein, eine RNA herzustellen, die fast alles bindet, ist der Grund, warum SELEX so nützlich ist.
Mit welchen Tools kann ich feststellen, ob ein pflanzenhomologes Protein auf die gleiche Weise mit einer ncRNA interagiert?
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