Ich versuche, miRNAs zu finden, die an die 3'UTR eines bestimmten Gens binden. Was ist der beste Weg, dies zu tun (d. h. mit einer guten Scoring-Analyse, die von Forschern in diesem Bereich am häufigsten verwendet wird)? Ich würde auch gerne die anderen möglichen Methoden kennen, wenn es mehrere Möglichkeiten gibt, dies zu tun.
Es gibt einige Tools zur Vorhersage der Bindung:
1 Kontext bedeutet die Position der Zielstelle in der 3'UTR und die umgebende Nukleotidzusammensetzung (die auch als indirekte Metrik der Sekundärstruktur angesehen wird)
miRanda und TargetScan haben auch Klassen, die als konservierte und nicht konservierte Ziele bezeichnet werden. miRanda meldet miRSVR-Scores und TargetScan meldet Kontext-Scores, aber diese Messungen basieren auf wenigen experimentellen Ergebnissen und könnennicht immer sinnvoll sein. miRSVR basiert auf einer Änderung der Zielexpression bei miRNA-Überexpression/Knockdown. Es verwendet auch Metriken für den Zielseitenkontext. Der Context+-Score von TargetScan umfasst viele Metriken, die neben dem regulären Kontext-Scoring auch die Häufigkeit und Erhaltung von Zielen umfassen. Einige dieser Metriken können nützlicher sein als die anderen. Aber Bewertungen, die nur auf miRNA-OE/KD-Experimenten basieren, können irreführend sein – insbesondere, wenn die Zielexpression nur auf RNA-Ebene quantifiziert wird. Die Zielhäufigkeit variiert auch zwischen verschiedenen Zelltypen. Weitere Einzelheiten zu diesen Metriken finden Sie in den entsprechenden Artikeln zu diesen Tools.
Es gibt einige experimentelle Verfahren zur Zielbestimmung, die hauptsächlich eine Protein-RNA-Vernetzung, gefolgt von einer Immunpräzipitation von Ago und einer anschließenden Quantifizierung durch RNA-Sequenzierung umfassen. Siehe HITS-CLIP und PAR-CLIP . Diese Techniken finden die Ziele nicht wirklich. Alles, was sie tun, ist, die miRNA-Mengen und ihre vorhergesagten Ziele, die an Ago gebunden sind, zu korrelieren (Sie werden nicht genau wissen, ob sich der ternäre mRNA-miRNA-Ago- Komplex wirklich gebildet hat oder nicht).
CLASH ist eine neuere Technik, die versucht, dieses Problem anzugehen, indem mRNA mit miRNA ligiert wird. Auf diese Weise können Sie die miRNA-mRNA-Interaktion erfassen. Allerdings bin ich etwas skeptisch gegenüber CLASH; Ich selbst habe vor einiger Zeit nach diesem Prinzip gearbeitet und mich dieser einen Herausforderung gestellt. CLASH umfasst grob die folgenden Schritte:
Mein Zweifel war, wie miRNA und mRNA ligiert werden würden, wenn der Fußabdruck von Ago größer als eine miRNA ist (gemeldet ~50-60 nt in HITS-CLIP und PAR-CLIP). Wenn die RNA nukleasegeschützt ist, wie kann sie dann für Ligase zugänglich sein? Als ich darüber nachdachte, dachte ich, dass ein teilweiser Proteinabbau notwendig wäre (nach dem RNAse-Schritt und vor dem Ligase-Schritt), um der Ligase etwas Raum zum Handeln zu geben. Irgendwann habe ich nicht weiter daran gearbeitet. Drei Jahre später wurde das CLASH-Papier veröffentlicht und ich war froh, dass jemand es zum Laufen gebracht hat. Aber das Ligase-Problem wurde nicht angesprochen (es scheint funktioniert zu haben, aber ich weiß nicht wie!!).
Um die Vorhersagen zu testen, können Sie einen Reporter-Assay (wie GFP oder Luciferase) verwenden, wobei die 3'UTR stromabwärts des Reporters geklont wird. Diese können auch Artefakte enthalten. Eine Überexpression der miRNA sollte vermieden werden und es sollten Seed-Mutationen durchgeführt werden, um die Targetierbarkeit sicherzustellen.
Eine andere Technik zur Bestimmung einer Ziel-mRNA besteht darin, ihre vorhergesagte miRNA-Bindungsstelle zu maskieren und die Auswirkung auf die Expression zu sehen. Dies wurde bei Zebrafischen unter Verwendung von Morpholinos durchgeführt, die komplementär zu Zielstellen waren, aber nicht bei anderen Modellen AFAIK. Dies scheint mir ein eleganter Assay zu sein - keine Überexpression und Sie können die Zielstelle genau bestimmen.
Ich würde die Literatur über die UTR, an der Sie interessiert sind, gründlich prüfen. Vieles davon wurde bereits für viele genomische Regionen durchgeführt, seit Nextgen Seq begonnen hat.
Sie sollten zunächst Computervorhersagealgorithmen verwenden, die Ihnen dabei helfen, eine gute Kandidatenliste von miRNAs zu erhalten
Die Wechselwirkung zwischen einer miRNA und ihren Ziel-mRNAs wird üblicherweise durch Co-Transfektion eines Reporter-Expressionsvektors untersucht, der die 3'-UTR-Region der mRNA und ein inhibitorisches oder Vorläufermolekül für die miRNA enthält.
Dies misst jedoch nicht die direkte und physikalische Wechselwirkung zwischen einer miRNA und einer spezifischen mRNA. Um die Bindung genauer zu messen, müssen Sie einen ElectroMobility Shift Assay durchführen.
Hier ist ein kommerzielles Tool, das gut funktioniert, wenn Sie nur versuchen, es zu identifizieren.
http://www.activemotif.com/catalog/905/lightswitch-synthetic-mirna-target-reporter-collection
Ich glaube nicht, dass es andere sehr effektive/einfache Methoden gibt.
Ich denke, Sie könnten so etwas wie hybridisieren, den Hyb auf einem Gel laufen lassen, das Band herausholen und es seqen
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