miRNA zielt auf mRNAs ab

Zuerst müssen Sie definieren, was Sie wirklich meinen, wenn miRNA-X auf mRNA-Y abzielt. Wenn Sie direktes Targeting meinen, gibt es Assays, um dies zu überprüfen.

Um zu überprüfen, ob die miRNA die mRNA möglicherweise unabhängig ansteuern kann, wird routinemäßig ein Reporter-Downregulationsassay (normalerweise Luciferase) durchgeführt. Sie klonieren die 3'UTR Ihrer Ziel-mRNA stromabwärts des Reportergens und überprüfen die Aktivität der Luciferase in An- und Abwesenheit von miRNA. Sie tun dies, indem Sie die miRNA und das Luciferase-Konstrukt co-transfizieren, das Zelllysat nach einiger Zeit (typischerweise 12/24/36 h nach der Transfektion) sammeln und die Luciferase-Aktivität mit einem Biolumineszenzzähler messen. Dies begründet nur die molekulare Möglichkeit des Targetings, sagt aber nicht wirklich aus, ob dasselbe tatsächlich in einem bestimmten Gewebe geschieht.

Reporter-Assays wie dieser können auch für In-vivo-Bedingungen modifiziert werden. Exprimieren Sie das Reporter-3'UTR-Konstrukt in Ihrem Organismus (oder spezifischem Gewebe). Verwenden Sie einen anderen Reporter mit einer mutierten Zielstelle in der 3'UTR, die das miRNA-Targeting aufhebt, und vergleichen Sie die Aktivitäten der beiden. Beim Zebrafisch verwenden die Menschen auch Oligonukleotide mit modifiziertem Rückgrat (Morpholinos), um die Zielstelle so zu maskieren, dass die miRNA nicht mehr auf die mRNA abzielen kann. Dieser Assay wird Target-Protection-Assay genannt .

Es gibt andere Assays, die keine Reportergene beinhalten, sondern tatsächlich an den Ago-Komplex gebundene miRNA und mRNA erfassen. Dies geschieht durch Protein-RNA-Crosslinking, gefolgt von Immunpräzipitation des Proteins (Ago), woraufhin die Sequenzierung der gebundenen RNA folgt. Weitere Informationen finden Sie in diesem Beitrag. Diese Assays geben Ihnen gewebespezifische Informationen, aber sie sagen Ihnen nur, ob eine miRNA und eine mRNA aneinander gebunden sind. Sie sagen nicht, ob die mRNA-Aktivität herunterreguliert ist oder nicht.

Das Targeting der mRNA durch miRNA, in-vivo (was bereits durch ektopische Reporter-Assays etabliert wurde) hängt von vielen Faktoren ab, von denen der wichtigste die relativen Konzentrationen dieser Moleküle und der Konkurrenten sind. Um eine Wirkung zu erzielen, muss die miRNA für jedes ihrer Ziele in ausreichender Konzentration vorliegen (wenn die miRNA viele Ziele hat, sinkt die Verfügbarkeit pro Ziel).

Wenn also eine miRNA-X in einem bestimmten Zustand tatsächlich auf eine mRNA-Y abzielt, dh sie herunterreguliert, muss sie dies in einem anderen Zustand nicht tun. Wir würden jedoch immer noch sagen, dass mRNA-Y ein gültiges Ziel von miRNA-X ist, wenn dies in mindestens einem Zustand der Fall ist, und besser, wenn es mithilfe von Reporter-Assays (ektopisch) validiert wurde.

Der mRNA-Targeting-Mechanismus ist hochspezifisch und hängt von verschiedenen Faktoren ab. Die Ziel-mRNA und der miRNA-Komplex sind sogar aus evolutionärer Sicht hoch konserviert. Es gibt viele In-vitro-Studien, die die Bedeutung der miRNA-Konzentration zeigen. Jetzt wird unter jeder Art von Krankheitszustand die normale Funktion von Zellen behindert und dies wirkt sich direkt aus die Transkriptionsebene. die Rate kann entweder steigen oder fallen.

Die mRNA-Zielregion für miRNA in der 3'UTR-Region ist hochspezifisch und hängt von der Komplementarität der Basenpaare zwischen mRNA und miRNA ab, aufgrund derer der miRNA-mRNA-Duplex exklusiv bleibt. Es gibt mehrere miRNAs, die für eine bestimmte mRNA gefunden wurden. Wenn Sie die Datenbank TargetHumanScan-Datenbank ( http://www.targetscan.org/ ) durchgehen, finden Sie viele miRNAs für eine bestimmte mRNA und umgekehrt.

Die Sorge hier ist nicht, ob irgendeine mRNA durch die bestimmte miRNA reguliert werden kann, sondern ob ihre positive Regulation oder negative Regulation, die von der Zelle in diesem bestimmten Krankheitszustand benötigt wird.

Darüber hinaus ist anzumerken, dass die Verwendung von 3'-UTRs und Polyadenylierungsstellen von Gewebe zu Gewebe variieren kann, sodass eine mRNA möglicherweise die verwandte miRNA-Bindungsstelle in einem Gewebe hat, aber nicht in einem anderen.