Wie extrahiert man RNA und führt RT-qPCR aus sehr wenigen Zellen (~5.000) durch?

Ich führe derzeit ein Experiment durch, das die FACS-Sortierung einer bestimmten Zellpopulation unter Verwendung eines interessierenden Antikörpers beinhaltet.

Um den Zelltyp zu validieren, den ich mit diesem Marker gesammelt habe, möchte ich eine qPCR an ihrer extrahierten RNA durchführen, wobei ich bestimmte bekannte Zelltyp-Marker-Primer verwende.

Mein Problem ist, dass ich bei jeder Sortiersitzung nur 5.000 bis 10.000 Zellen sammeln kann. Wissen Sie, ob es möglich ist, RT-qPCR mit einer so kleinen Probengröße durchzuführen?

Ich habe die Zellen in 1 ml Trizol gesammelt.

Müsste ich vielleicht die cDNA nach der reversen Transkription auf allgemeine Weise (unter Verwendung von Zufallsprimern) amplifizieren?

Danke für Ihre Hilfe.

Ein Versuch würde nicht schaden. Mit den richtigen Primern und genügend PCR-Zyklen sollten Sie in der Lage sein, fast alles zu amplifizieren, wenn auch vielleicht nicht perfekt.
Ich denke, das sollte möglich sein, obwohl Sie nicht sehr viel cDNA bekommen werden, also haben Sie wahrscheinlich nur einen Schuss. Abgesehen davon: Warum verwenden Sie so viel Trizol? Ich habe normalerweise 1 ml für eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen verwendet, die viel mehr Zellen enthält. Stellen Sie beim Präzipitieren sicher, dass Sie ein Co-Präzipitationsmittel als Glykogen verwenden, damit Sie keine Probe verlieren. Und Sie werden das RNA-Pellet mit so wenigen Zellen wahrscheinlich nicht sehen.
Danke Chris. Wie viel Trizol würden Sie empfehlen? Ich verwende 1 ml, weil ich in 1,5-Epp-Röhrchen sortiere und versuche zu verhindern, dass die Zellen an den Wänden des Röhrchens haften bleiben, wenn sie den Sortierer verlassen. Wäre es sinnvoll, die gesamte cDNA nach RT zu amplifizieren? (Unspezifisch, nur zufällige Primer-Amplifikation?)
Wollen Sie die cDNA nicht sowieso in Ihrer qPCR amplifizieren? Eine Vorverstärkung würde wahrscheinlich Probleme mit Ihren Daten verursachen.
Ich würde die DNA nicht voramplifizieren, da dies viele Probleme mit sich bringen kann, wenn die Verhältnisse zwischen den RNAs beeinflusst werden. Selbst wenn Ihre Zellen an der Wand des Röhrchens haften, werden die Zellen lysiert, wenn Sie das Röhrchen vortexen. Sehen Sie, wie viel Trizol für welche Zellzahl empfohlen wird, wenn ich mich recht erinnere, gibt es einen Teil in der Bedienungsanleitung. Abgesehen davon, dass Sie nicht so viel Trizol benötigen, sparen Sie auch Geld und produzieren weniger schädliche Abfälle.
1ml Trizol ist ziemlich viel. Ich verwende so viel für ~ 1 Million Zellen (ein Well einer 12-Well-Platte - für HeLa. Sie benötigen im Allgemeinen die Hälfte davon). Sie können auch eines der RNA-Extraktionskits ausprobieren. Fügen Sie DNAse-I hinzu, um alle DNA-Spuren zu entfernen. Führen Sie keine zufällige Primer-Amplifikation durch. Schau mal hier

Antworten (2)

Sie können die Verwendung von Einzelzell-RT-qPCR-Kits wie diesem in Betracht ziehen, wenn Sie das Budget dafür haben. (Hinweis: Ich habe dieses Kit nicht persönlich verwendet, sondern nur eine Idee veröffentlicht.)

Das Ambion® Single Cell-to-CT™ Kit enthält einen vollständig validierten Arbeitsablauf für die Genexpressionsanalyse für Proben mit 1–10 Zellen. Jedes Kit enthält Reagenzien für die Probenvorbereitung, reverse Transkription, Präamplifikation und qPCR, die zusammen in einem einfachen Arbeitsablauf optimiert wurden, der in nur 5 Schritten abgeschlossen werden kann (siehe Abbildung).

Mit einer guten Technik können Sie RT-PCR oder RT-qPCR zuverlässig mit einer Probengröße von etwa 100 Zellen durchführen. Einige der Kommentare sind richtig, dass Sie die Reduzierung der anfänglichen Zellzufuhr durch zusätzliche PCR-Zyklen kompensieren müssen. Jede Größenordnung der Zellreduktion entspricht jedoch etwa 3 zusätzlichen PCR-Zyklen (2^3 = 8 ~= 10), sodass sich Ihre Gesamtzahl der qPCR-Zyklen nicht wesentlich ändert.

Da Sie es mit einer kleinen Menge an Zellen zu tun haben und mit TRIzol isolieren, könnte das Pellet schwer zu sehen sein. Ich würde vorschlagen, dass Sie etwas wie Glykogen ( Glycoblue von Ambion ) verwenden, um das Pellet zu etwas sichtbarerem zu präzipitieren. Sie würden dies vor dem Isopropanol hinzufügen, um Ihre Nukleinsäuren auszufällen.

Ihre Verwendung von zusätzlichem TRIzol ist kein Problem, es sei denn, Ihr Labor ist knapp bei Kasse. Es wird Ihre Nukleinsäurekonzentration verdünnen, was die Ausfällung erschwert, aber die Verwendung von Glykogen gleicht dies aus. Die Verwendung einer geringeren Menge als die manuell festgelegten Verhältnisse kann problematisch sein, da dies zu einer unvollständigen Lyse und Denaturierung Ihrer Zellkomponenten führen kann.

Wie user137 empfiehlt, ist eine Vorverstärkung der Produkte keine gute Idee, da dies wahrscheinlich Ihre Endergebnisse verzerren wird. Ich bin mir nicht sicher, welche Genexpressionen Sie sich ansehen, aber es ist immer eine gute Idee, mehrere Haushaltsgene als Basiswerte für die Berechnung Ihrer relativen Expressionszahlen einzubeziehen, vorausgesetzt, Sie haben genügend RNA-Isolat, das Sie als Eingabe verwenden können.

Wie extrahiert man RNA und führt RT-qPCR aus sehr wenigen Zellen (~5.000) durch?
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