Wie ist eine RT-PCR repräsentativ für den RNA-Gehalt in einer Zelle?

Zum Beispiel sammeln wir zuerst alle RNA-Inhalte aus einer Säugetier-Zelllinie. Sagen wir zum Beispiel, wir sammeln 80 ul RNA mit einer Konzentration von 150 ng/ul. Als nächstes nehmen wir 1.000 ng der RNA, um cDNA herzustellen. Diese 1.000 ng sind jedoch eine völlig zufällige Stichprobe der gesamten RNA, die wir hatten. Wie ist diese zufällige RNA-Probe repräsentativ für den RNA-Gehalt ursprünglich in unseren Zellen?

Fragen Sie, ob mRNA-Moleküle, die nur in wenigen Kopien vorhanden sind, durch Zufallsstichproben verzerrt werden können? Das stimmt sicherlich.

Antworten (1)

Es ist nicht wirklich klar, was der Fragesteller genau fragt, aber ...

... eine Möglichkeit, darüber nachzudenken, besteht darin, zu fragen, wie wahrscheinlich es ist, dass eine RNA mit geringer Häufigkeit in der Probe fehlt, die bei der RNA-Präparation entnommen wurde. Dies würde die Stichprobe auf qualitativer Ebene nicht repräsentativ machen.

Die Frage besagt, dass 12.000 ng RNA isoliert werden. Da nichts anderes angegeben ist, gehe ich davon aus, dass es sich um Gesamt-RNA handelt. Eine grobe Schätzung der Gesamt-RNA pro eukaryotischer Zelle beträgt 20 pg.

Das bedeutet, dass die Präparation aus 6 x 10 5 Zellen stammte. (Ich gehe von 100 % Ausbeute aus, aber das wird die Schlussfolgerung nicht wirklich beeinflussen.)

Nehmen Sie nun an, dass eine mRNA mit geringer Häufigkeit bei 10 Kopien pro Zelle vorhanden ist. Das gesamte RNA-Präparat enthält daher 6 × 10 6 Kopien dieser mRNA mit geringer Häufigkeit.

Von den insgesamt 12.000 ng nehmen wir eine Probe von 1.000 ng. Mit anderen Worten, wir nehmen 1/12 der RNA-Präparation. Wenn dieses RNA-Präparat 10 6 Kopien der mRNA mit geringer Häufigkeit enthält, wie wahrscheinlich ist es, dass wir zufällig eine Probe entnehmen, die keine Kopien dieser mRNA mit geringer Häufigkeit enthält? Hier versagt meine Mathematik, aber intuitiv sage ich, dass die Wahrscheinlichkeit sehr sehr gering ist .

Nun, wenn es 1.000 verschiedene mRNAs in geringer Häufigkeit in der Zelle gibt, ist die Wahrscheinlichkeit, jede von ihnen zu übersehen , sehr, sehr gering , aber die Gesamtwahrscheinlichkeit, eine von ihnen zu übersehen, ist 1000 x sehr, sehr gering , also vielleicht sehr gering .

Ich werde weiter darüber nachdenken, wie man den Wert sehr sehr klein berechnet , aber wenn jemand helfen möchte - danke im Voraus!

Um meine Frage zu ergänzen, was ist, wenn Sie die Einbeziehung eines Exons überprüfen und sagen wir, wenn wir davon ausgehen, dass das alternative Exon in 15% von Gen X auftaucht. Wenn wir jedoch ein zufälliges 12. nehmen, könnte das 12. nicht sein nicht repräsentativ und zeigen so etwas wie 60% Inklusion, obwohl es eigentlich viel niedriger sein sollte?
Ja, es gibt alle möglichen Arten, auf denen die endgültige cDNA-Mischung aufgrund des Zufalls eine ziemlich verzerrte Widerspiegelung der ursprünglichen mRNA-Verteilung sein könnte, wie Roland in seinem Kommentar sagte.
Wie ist eine RT-PCR repräsentativ für den RNA-Gehalt in einer Zelle?
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