Wir versuchen herauszufinden, ob eine Zunahme oder Abnahme der zytoplasmatischen Calciumkonzentration die Wechselwirkung zweier Proteine beeinflusst, indem wir co-IP in HEK293T-Zellen als Readout verwenden.
In verschiedenen Foren und Artikeln habe ich herausgefunden, dass es zur Erhöhung des zytoplasmatischen Ca2+-Spiegels in nicht erregbaren Zellen drei Hauptkategorien von Verbindungen gibt. Ionophore (A23187, Ionomycin), Agonisten der InsP3-PKC-Signalübertragung (Carbachol, ATP) und SERCA-Inhibitoren (Thapsigargin, CPA).
Unterschiedliche Fachzeitschriften und unterschiedliche Personen wenden jedoch unterschiedliche Konzentrationen und Behandlungsdauern an. Da viele der Medikamente eher vorübergehende Spitzen erzeugen, ist mir klar, dass das Timing hier entscheidend ist. Da uns die Ressourcen zur Optimierung der [Ca2+]-sensierenden Farbstoffbildgebung fehlen, frage ich mich auch, ob es eine einfachere Möglichkeit gibt, [Ca2+] grob abzuschätzen, vielleicht durch die Analyse eines Markerproteins/RNA mittels Western Blot oder qPCR?
Vielen Dank!
Soweit ich weiß, ist die Mikroskopie (sei es mit Farbstoffen wie Fluor oder mit genomcodierten Kalziumindikatoren) wirklich die einzige gute Wahl, insbesondere um quantitative Empfindlichkeit zu erhalten, was meiner Meinung nach das ist, wonach Sie suchen. Änderungen des zytosolischen Kalziums sind sowohl zeitlich als auch räumlich unglaublich dynamisch, was bei der Frage, wie Kalzium Ihre beiden Proteine beeinflusst, berücksichtigt werden sollte.
Ich kenne ein Beispiel, bei dem Forscher Zellen in Puffer mit unterschiedlichen Ca2+-Konzentrationen überführten und sie mit einem milden Reinigungsmittel permeabilisierten, um den Kalziumspiegel zu erhöhen (Borges-Pereira et al. 2015). Ich bin mir nicht sicher, ob das für Ihr System funktionieren würde, aber es lohnt sich, einen Blick darauf zu werfen, da ich denke, dass es die Werte ziemlich sanft und stetig anhebt und Sie eine bessere Vorstellung davon haben, wie Ihre intrazelluläre Konzentration sein wird, ohne direkt zu visualisieren Es. In Anbetracht der Tatsache, dass Sie die Ca2+-Konzentration zu keinem bestimmten Zeitpunkt ohne Mikroskopie bestimmen können, könnten Dinge wie SOCE und intrazelluläre Chelatraten wichtig sein, also sollten Sie darauf achten, wann Sie nach der Behandlung mit Ihrem Assay beginnen, vielleicht versuchen Sie es mit a wenige unterschiedliche Zeitpunkte
Hoffe das war etwas hilfreich!