Wenn ich hypothetisch eine inaktive Version von Cas9 oder ZFN herstelle (die an die DNA bindet, aber die Spaltungsreaktion nicht anwendet). Was passiert, nachdem das Protein an die DNA gebunden ist? Wird es für immer dort stecken bleiben und den Transkriptions-/Übersetzungsprozess stören? Oder löst es sich nach einer Weile von selbst?
Alle Bindungsreaktionen sind reversibel. Das Binden und Lösen (Assoziieren und Dissoziieren) sind normalerweise im Gleichgewicht. Wie viel des Proteins an die DNA gebunden wird und wie viel Zeit ein einzelnes Molekül im gebundenen Zustand verbringt, hängt von den kinetischen Parametern ab. Im Fall des nicht-katalytischen Cas kann das Protein die Transkription hemmen, wenn es an den Promotor gebunden ist. Tatsächlich wurden solche inaktiven Varianten entwickelt und zur gezielten Hemmung der Transkription verwendet ( Himeda et al., 2015 ).
Wenn das CRISPR-Cas eine Bindungsstelle für einen Transkriptionsaktivator blockiert, dann würde der Grad der Hemmung von der Konkurrenz zwischen dem Aktivator und dem CRISPR-Cas -Inhibitor um die Bindungsstellen abhängen. Diese Konkurrenz wäre von den kinetischen Parametern sowie der Konzentration der konkurrierenden Spezies abhängig.
Auf ähnliche Weise können Sie Proteine/RNAs entwerfen, die an mRNAs binden (bei RBS in Prokaryoten oder Kozak-Sequenzen in Eukaryoten) und die Translation hemmen können.
Eine weitere interessante Tatsache: Das CRISPR-Cas- System wurde so konstruiert, dass es auch wie ein Transkriptionsaktivator funktioniert ( Didovyk et al., 2016 ).
Immer verwirrt