Ich möchte zwei fluoreszierende Proteine, die beide von unterschiedlichen Promotoren angetrieben werden, in einem Plasmid klonieren, das zur Transformation von B. subtilis am amyE-Locus verwendet werden soll. Dazu möchte ich das Plasmid pSG1729 (Lewis und Marston, 1999) verwenden, da dieses Plasmid für die homologe Rekombination an diesem spezifischen Locus verwendet werden kann.
Nun ist das Problem aus einigen Gründen (dh die Positionen der Restriktionsstellen, das Beibehalten des spc-Resistenzgens und das Löschen des aktuellen GFP-Gens), wenn ich zwei Gene in dieses Plasmid klonen möchte, werden sie sehr nahe beieinander liegen einander (~10bp). Wird dies nach der Transformation entweder technisch oder biologisch ein Problem sein? Ich denke nicht, dass ein mögliches Durchlesen schlecht sein wird, da ich möchte, dass eines der fluoreszierenden Proteine (pHluorin) kontinuierlich exprimiert wird. Vielleicht wäre es eine Option, die beiden Gene in entgegengesetzte Richtungen zu klonen?
Dies ist der aktuelle Genotyp des Plasmids:
Ori amyE5' currentGFP Spc amyE3' bla
Wenn Sie sie in einem Operon ausdrücken möchten, stellen Sie sicher, dass Sie eine RBS am 5'-Ende jeder Codierungssequenz haben. Wenn Sie einen 10-bp-Downstream ohne RBS platzieren, wird er transkribiert, aber nicht übersetzt ... Wenn Sie weitere Hilfe benötigen, fügen Sie den DNA-Code von jedem als Kommentar ein.
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bSubspore
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