Warum wird SOC-Medium für Transformationen empfohlen?

Zusammenfassend aus Hanahans Artikel (siehe unten als Referenz), führte er eine systematische Überprüfung der Bedingungen durch, die notwendig sind, um die Transfektionseffizienz zu verbessern. Zu den getesteten Bedingungen gehörten das Vorhandensein verschiedener Kationen (Ca ²⁺ , Cs ⁺ , Mn ²⁺ , K ⁺ , Mg ²⁺ ), DMSO und Wachstumstemperaturen (und einige andere Bedingungen, die heutzutage nicht mehr so ​​häufig verwendet werden). Er arbeitete mit einem Stamm, von dem er anschließend ein Derivat namens DH1 isolierte, das jetzt im Handel als DH1-alpha und andere Stammderivate erhältlich ist.

Er definierte die Transformationseffizienz als die Anzahl der transformierten Kolonien auf einer Platte, ein Maß, das noch heute verwendet wird. Er fand heraus, wenn die Transformationsmedien enthielten: bestimmte Kationen, insbesondere Mn ²⁺ , Ca ²⁺ , Rb ⁺ ; sowie DTT, Hexamin-Kobalt(III) und DMSO; ^{die Transfektionseffizienz im Vergleich zur Standard-Ca 2+} -Behandlung stark verbessert . Er fand auch heraus, dass Saccharose und K ⁺ nützlich waren, obwohl sie für seine experimentelle Belastung nicht unbedingt notwendig waren. Es wurde in dieser Veröffentlichung angegeben, obwohl es nicht erklärt wurde, dass Saccharose als Stabilisator wirkte, möglicherweise um ihn vor seiner anfänglichen Verwendung von 0°C-Inkubation und/oder Gefrier/Auftau-Zyklen zu schützen. Für den Rest seiner Arbeit verwendete er keine Saccharose.

Unter seinen Schlussfolgerungen stellt er fest, dass DTT notwendig ist, sowie zweiwertige und einwertige Kationen, aber dass sie unspezifisch zu sein scheinen. Mit anderen Worten, es gibt keine strikte Anforderung, Ca ²⁺ zu haben, da Mg ²⁺ und Mn ²⁺ gleich gut funktionieren, noch gibt es eine Anforderung für K ⁺ , obwohl es zugegebenermaßen einfacher zu verwenden ist als Rb+.

Heutzutage gibt es eine Reihe von "reichen" Medienbrühen, die erhältlich sind: SOB, SOC (SOB + MgCl ₂ und Saccharose), 2xYT, NZY+, TB usw. Alle diese sind LB für Transformationszwecke aufgrund des raffinierten Salzes überlegen Ausgewogenheit und insbesondere der Einschluss dieser zweiwertigen und einwertigen Kationen. Saccharose scheint für die Leichtigkeit des Stoffwechsels und die Stabilität des Hitzeschockprozesses enthalten zu sein (obwohl ich kein Papier finden kann, das ausdrücklich erklärt, warum es verwendet wird, außer der Tradition).

Die beiden häufigsten Methoden zur Transformation von Bakterien bestehen darin, sie chemisch kompetent zu machen (E. coli bereits in einer reichhaltigen Medienbrühe) oder sie elektrisch zu transformieren (Elektroporation). Der Zweck von beiden besteht darin, Löcher in die Zellmembran von E. coli zu induzieren (die chemische Transformation beruht dafür auf dem Hitzeschockprozess). Sobald diese Löcher gemacht sind, kann die DNA frei in die Bakterien eindringen. Natürlich ist dieser Vorgang für die E. coli sehr traumatisierend, insbesondere da die chemische Umwandlung die zusätzliche Belastung durch einen Temperaturschock (0°C auf 42°C und dann wieder zurück auf 0°C) mit sich bringt.

Das Ersetzen von LB durch eine reichhaltige Brühe, wie z. B. SOC, wird die Transformationsausbeute erheblich verbessern. Wenn ein Protokoll SOC-Medien erfordert und Sie keine haben, können Sie sie durch andere Rich Media ersetzen. Ich habe 2xYT oft sehr erfolgreich für SOC verwendet, und wie ich bereits sagte, scheint nur die Wertigkeitszahl für die verschiedenen Ionen von Bedeutung zu sein, also stellen Sie einfach sicher, dass sie vorhanden sind.

Nach meinem Verständnis wurde Saccharose/Glucose als zusätzliche Nährstoffquelle für E. coli hinzugefügt, um ihre Erholung vom Transformationsprotokoll zu beschleunigen. Ich vermute, dass dies der Fall ist. Hanahan bezeichnet Saccharose als Stabilisator, definiert aber nicht, was es stabilisiert. Ich spekuliere, dass es als Kryokonservierungshilfsmittel wirkt und die Bildung von Eiskristallen verhindert, wenn es in der Hitzeschockmethode auf Eis gekühlt wird. In Anbetracht der früheren bio.SE-Frage über die Umstellung von E. coli -Ausgangsmaterialien erscheint es unwahrscheinlich, dass Saccharose in der einstündigen Wachstumsperiode unmittelbar nach der Transformation als Nährstoffquelle verwendet wird, da dieser Artikel 4-12 Stunden als üblichen Zeitraum für die Umstellung angibt Stoffwechsel von Aminosäuren zu Kohlenhydraten.

Quellen:

• Hanahan D. Studien zur Transformation von Escherichia coli mit Plasmiden. J. Mol. Biol. 1983, 166(4): 557-80.

( Super Optimal Broth with Catabolite Repression ) SOC-Medium enthält Glukose, während Luria Broth (LB) dies nicht tut. SOB hat auch ein empfindlicheres Salzgleichgewicht.

Natürlich hilft die Glukose den Zellen, sich nach dem Hitzeschock zu erholen und schneller zu wachsen. Ihre Transformationseffizienz sollte sich verbessern, da weniger Zellen sterben.

Andererseits liegt der Grund, warum SOC-Medien nicht immer verwendet werden, in den schädlichen Auswirkungen von zu viel Glukose. Die Glukose wird im Krebszyklus verbraucht und produziert viel Acetat, das für die Zellen ziemlich hart sein kann.