Wir fügten das GFP-Gen in das Plasmid Bluescript SK+ ein, transformierten E. coli mit diesem Konstrukt und plattierten es dann auf einer Agarplatte mit Ampicillin und X-Gal, um ein Blau/Weiß-Screening durchzuführen. Wir haben blaue Kolonien und weiße Kolonien, und normalerweise gelten die weißen Kolonien als positiv für das Insert und die blauen als negativ für das Insert. Das Problem ist, dass die Ergebnisse, die wir erhalten haben, eigentlich das Gegenteil sind. Wenn wir die Platte unter UV-Licht betrachten, sehen wir, dass ALLE blauen Kolonien fluoreszieren, was bedeutet, dass sie tatsächlich das GFP produzieren, und ALLE weißen nicht!! Wie würdet ihr das erklären?? Vielen Dank
Bearbeiten: Ich dachte, dass das Insert vielleicht im Frame mit Lacz sein könnte, also bekommen wir Fusionsproteine. Dies erklärt jedoch nicht, warum wir weiße Kolonien erhalten haben, die nicht fluoreszieren
Angesichts der Tatsache, dass die ungeschnittenen Plasmide der Negativkontrolle weiße Kolonien produzieren, scheint es, dass signifikante Mutationen innerhalb des lacZ-Gens im Plasmid aufgetreten sind, was dazu führt, dass die ungeschnittenen Plasmide aufgrund der Inaktivierung des Gens weiß werden.
Ich würde vorschlagen, eine neue Charge von pBluescript zu kaufen, oder wenn dies aus irgendeinem Grund nicht möglich ist, eine Miniprep an einer der blauen Kolonien durchzuführen und ihre multiple Klonierungsstelle zu sequenzieren, um zu überprüfen, ob das MCS vorhanden und nicht mutiert ist, bevor Sie fortfahren. Wenn Sie keine neue Charge Plasmide kaufen, wäre es auch ratsam, die Länge des Plasmids mittels Gelelektrophorese zu überprüfen.
Die wahrscheinlichste Erklärung ist, dass die Plasmide mutiert sind und Sie daher schlechte Ergebnisse im Blau/Weiß-Bildschirm erhalten.
März Ho
Alice
März Ho
Alice
Kanadier